本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，涉及傷口感染相關(guān)病原體的檢測(cè)，更具體地，涉及大芬戈?duì)柕戮?、紋帶棒狀桿菌、厭氧消化鏈球菌、不解糖消化鏈球菌、普氏厭氧球菌的檢測(cè)。

背景技術(shù)：

1、大芬戈?duì)柕戮?finegoldia?magna)是革蘭氏陽(yáng)性菌的一個(gè)屬，是梭狀芽胞桿菌類的厭氧球菌，作為一種機(jī)會(huì)性人類病原體，通常在皮膚和粘膜上定植，經(jīng)常出現(xiàn)在慢性潰瘍的生物膜中，例如糖尿病足或褥瘡潰瘍。大芬戈?duì)柕戮侨祟惼つw和黏膜的正常共生體，主要存在于皮膚、胃腸道和泌尿生殖道。它在厭氧菌感染中占5-12％，在革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌中占20-40％。這種病原體與假體植入術(shù)后的關(guān)節(jié)感染、皮膚和軟組織感染有關(guān)。

2、紋帶棒狀桿菌(bacteroides?ureolyticus)是革蘭氏陰性專性厭氧菌屬的一個(gè)物種。紋帶棒狀桿菌是腸道常見(jiàn)菌，通常不致病，但在免疫功能低下時(shí)可能引起感染，如腹腔、盆腔等部位的膿腫。

3、厭氧消化鏈球菌(peptostreptococcus?anaerobius)、不解糖消化鏈球菌(peptoniphilus?asaccharolyticus)、普氏厭氧球菌(anaerococcus?prevotii)均為消化鏈球菌屬，消化鏈球菌屬為真細(xì)菌目消化鏈球菌科的一屬革蘭氏陽(yáng)性菌。此屬菌是哺乳動(dòng)物口腔、粘液膜和腸道的專性寄生者，可能在化膿感染中起作用。消化鏈球菌是生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌，有時(shí)對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。在免疫抑制或創(chuàng)傷條件下，這些菌會(huì)變成致病菌，并導(dǎo)致敗血癥，損害宿主。消化鏈球菌可導(dǎo)致腦、肝、乳腺和肺膿腫，以及全身壞死性軟組織感染。

4、傷口感染的檢測(cè)在臨床上具有重要意義，及時(shí)檢測(cè)和確認(rèn)傷口感染的病原體，有助于避免感染在患者體內(nèi)進(jìn)一步擴(kuò)散，特別是在免疫系統(tǒng)較弱的患者中，如糖尿病患者、老年人或術(shù)后患者。早期檢測(cè)有助于降低感染擴(kuò)散至其他組織甚至全身的風(fēng)險(xiǎn)，傷口感染通常涉及復(fù)雜的微生物，包括耐藥性較強(qiáng)的病原體。檢測(cè)可以提供感染病原體的種類及其耐藥性信息，幫助醫(yī)生選擇最有效的抗菌藥物，減少不必要的抗生素使用，從而降低抗生素耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)。傷口感染若得不到有效控制，可能會(huì)導(dǎo)致局部或全身并發(fā)癥，如敗血癥、組織壞死等。對(duì)感染病原體的快速檢測(cè)和識(shí)別能幫助及時(shí)采取針對(duì)性措施，從而降低嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生概率；對(duì)于手術(shù)傷口的患者，及時(shí)檢測(cè)傷口是否存在感染以及確認(rèn)感染的病原體類型，可避免術(shù)后感染引發(fā)的傷口愈合延遲或其他術(shù)后并發(fā)癥，支持術(shù)后康復(fù)進(jìn)程，減少住院時(shí)間。

5、因此，本領(lǐng)域需求一種產(chǎn)品能夠簡(jiǎn)單、快速地檢測(cè)上述病原體，并且具有良好的靈敏度和特異性，能夠檢測(cè)并區(qū)分引起傷口感染的病原體微生物，以便針對(duì)性地為上述傷口感染的防治提供策略。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，第一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)傷口感染相關(guān)病原體的組合物，包括檢測(cè)如下病原體中至少4種的上下游引物和探針：

2、如seq?id?no:1～3所示的檢測(cè)大芬戈?duì)柕戮纳嫌我?、下游引物及探針?/p>

3、如seq?id?no:4～6所示的檢測(cè)紋帶棒狀桿菌的上游引物、下游引物及探針；

4、如seq?id?no:7～9所示的檢測(cè)厭氧消化鏈球菌的上游引物、下游引物及探針；

5、如seq?id?no:10～12所示的檢測(cè)不解糖消化鏈球菌的上游引物、下游引物及探針；或

6、如seq?id?no:13～15所示的檢測(cè)普氏厭氧球菌的上游引物、下游引物及探針。

7、本發(fā)明提供的聯(lián)檢的組合物，主要利用多重?zé)晒鈖cr分析方法，通過(guò)檢測(cè)不同病原體上的靶點(diǎn)，對(duì)不同病原體進(jìn)行檢測(cè)，從而在單管反應(yīng)體系中同時(shí)實(shí)現(xiàn)大芬戈?duì)柕戮?、紋帶棒狀桿菌、厭氧消化鏈球菌、不解糖消化鏈球菌，以及普氏厭氧球菌中至少4種的檢測(cè)和區(qū)分，以便為傷口感染防治提供針對(duì)性策略。本發(fā)明的組合物，其檢測(cè)的靈敏度更高，達(dá)到500拷貝/ml，特異性好，檢測(cè)更為準(zhǔn)確，能夠提供較為充分的快速檢測(cè)以及排除不同病原體感染的依據(jù)，縮短傷口感染誘因的判斷時(shí)間，加快實(shí)施應(yīng)對(duì)措施。

8、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種檢測(cè)傷口感染相關(guān)病原體的組合物，包括：

9、如seq?id?no:1～3所示的檢測(cè)大芬戈?duì)柕戮纳嫌我?、下游引物及探針?/p>

10、如seq?id?no:4～6所示的檢測(cè)紋帶棒狀桿菌的上游引物、下游引物及探針；

11、如seq?id?no:7～9所示的檢測(cè)厭氧消化鏈球菌的上游引物、下游引物及探針；

12、如seq?id?no:10～12所示的檢測(cè)不解糖消化鏈球菌的上游引物、下游引物及探針；以及

13、如seq?id?no:13～15所示的檢測(cè)普氏厭氧球菌的上游引物、下游引物及探針。

14、進(jìn)一步地，所述組合物包括檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的上游引物、下游引物及探針。

15、在一些具體的實(shí)施方案中，針對(duì)樣本添加外源性內(nèi)標(biāo)，進(jìn)一步地，所述內(nèi)標(biāo)是人源內(nèi)標(biāo)基因。

16、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，內(nèi)標(biāo)是rnase?p或者gapdh。

17、進(jìn)一步地，本發(fā)明組合物檢測(cè)不同病原體的探針之間的熒光基團(tuán)彼此互不相同且互不干擾。

18、在本文中，“互不相同且互不干擾”是指組合物中每個(gè)探針?biāo)玫臒晒饣鶊F(tuán)是不一樣的，并且不會(huì)影響彼此的檢測(cè)，即可以利用不同的通道進(jìn)行檢測(cè)。例如可以使用atto425、quasar705、fam、hex、rox和cy5，這些基團(tuán)吸光值不接近，能選擇不同的通道，因而不會(huì)互相干擾。

19、在一些具體的實(shí)施方案中，檢測(cè)大芬戈?duì)柕戮奶结樀臒晒鈭?bào)告基團(tuán)為fam；檢測(cè)紋帶棒狀桿菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為hex；檢測(cè)厭氧消化鏈球菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為rox；檢測(cè)不解糖消化鏈球菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為cy5；檢測(cè)普氏厭氧球菌的探針的熒光報(bào)告基團(tuán)為quasar?705。

20、進(jìn)一步地，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以同時(shí)包括上述引物和探針對(duì)中的一組或多組。在本發(fā)明中，“組”是指檢測(cè)一個(gè)靶點(diǎn)的互相匹配的上游引物、下游引物和探針。

21、本發(fā)明的組合物可以任意組合成檢測(cè)對(duì)應(yīng)5個(gè)靶點(diǎn)的任意組合形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行組合，檢測(cè)哪幾個(gè)靶點(diǎn)，即把對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的上下游引物和探針對(duì)進(jìn)行組合即可。這些組合形式均包括在本發(fā)明中。

22、舉例來(lái)說(shuō)，可以包括上述5組引物和探針中的任意4組，可以包括上述5組引物和探針中的任意3組，也可以包括上述5組引物和探針中的任意2組，也可以包括上述5組引物和探針中的任意1組。

23、在一些具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物用于熒光pcr。

24、進(jìn)一步地，探針的3’末端還具有非熒光淬滅劑。

25、進(jìn)一步地，探針的3’末端還具有淬滅基團(tuán)，例如bhq1或bhq2。

26、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，探針的3’末端的淬滅基團(tuán)為bhq1。

27、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物的各成分分別存在于單獨(dú)包裝中。

28、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物的各成分存在于同一個(gè)包裝中。

29、進(jìn)一步地，本發(fā)明的組合物的各成分以混合的形式存在。

30、第二方面，本發(fā)明提供了上述本發(fā)明的組合物在制備檢測(cè)傷口感染相關(guān)病原體的試劑盒中的用途，其中，所述病原體為不解糖消化鏈球菌、大芬戈?duì)柕戮⒓y帶棒狀桿菌、厭氧消化鏈球菌，或普氏厭氧球菌中的一種或多種。

31、第三方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)傷口感染相關(guān)病原體的試劑盒，所述試劑盒包括如上所述本發(fā)明的組合物。

32、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品。

33、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，陰性質(zhì)控品是depc?h2o、生理鹽水中的至少一種；陽(yáng)性質(zhì)控品是不解糖消化鏈球菌、大芬戈?duì)柕戮?、紋帶棒狀桿菌、厭氧消化鏈球菌、普氏厭氧球菌的片段質(zhì)?；蜿?yáng)性菌株中的至少一種。

34、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括dntp(u)s、pcr緩沖液以及mg2+中的至少一種。

35、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括dna聚合酶、尿嘧啶糖基化酶(ung酶)中的至少一種。

36、更進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括核酸釋放試劑、核酸提取試劑中的至少一種。

37、更進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括核酸釋放試劑、核酸提取試劑、dntp、dutp、尿嘧啶糖基化酶(ung酶)、dna聚合酶、pcr緩沖液以及mg2+中的至少一種。

38、進(jìn)一步地，所述dna聚合酶的濃度為5u/反應(yīng)～15u/反應(yīng)，例如dna聚合酶可以是taq酶。

39、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒包括taq酶、ung酶、mg2+、dntp(u)s、引物、探針和pcr緩沖液。

40、pcr緩沖液的主要成分包括tris-hcl、nacl、nh4cl、tween?20。

41、在一些具體的實(shí)施方案中，單個(gè)pcr反應(yīng)管中反應(yīng)物總體積為20μl～60μl。

42、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒可以兼容數(shù)字pcr擴(kuò)增體系，即可以直接用于數(shù)字pcr儀上進(jìn)行擴(kuò)增。

43、第四方面，提供了一種用于檢測(cè)傷口感染相關(guān)病原體的方法，所述方法包括以下步驟：

44、1)提取待測(cè)樣本的核酸；

45、2)使用如上所述本發(fā)明的組合物或上述本發(fā)明的試劑盒對(duì)步驟1)獲得的核酸進(jìn)行熒光pcr檢測(cè)；

46、3)獲得并分析結(jié)果。

47、在本發(fā)明中，用于檢測(cè)的樣本可以是組織液或傷口滲出物等，但不限于此。

48、進(jìn)一步地，所述熒光定量pcr的反應(yīng)條件為：

49、ung去污染，溫度為50～65℃，時(shí)間為1～5分鐘，1次循環(huán)；預(yù)變性，溫度為90～99℃，時(shí)間為0.5～6min，1次循環(huán)；變性，溫度為90～99℃，時(shí)間為5～20秒，退火，溫度為55℃～60℃，時(shí)間為10～60秒，30～50次循環(huán)，采集熒光。

50、進(jìn)一步地，所述檢測(cè)傷口感染相關(guān)病原體的方法為非診斷目的。

51、在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，提供了一種組合物用于制備檢測(cè)傷口感染相關(guān)病原體的試劑的用途，所述檢測(cè)包括以下步驟：

52、1)提取待測(cè)樣本的核酸；

53、2)使用如上述本發(fā)明的組合物或上述本發(fā)明的試劑盒對(duì)步驟1)獲得的核酸進(jìn)行熒光pcr檢測(cè)；

54、3)獲得并分析結(jié)果。

55、進(jìn)一步地，所述熒光定量pcr的反應(yīng)條件為：

56、ung去污染，溫度為50～65℃，時(shí)間為1～5分鐘，1次循環(huán)；預(yù)變性，溫度為90～99℃，時(shí)間為0.5～6min，1次循環(huán)；變性，溫度為90～99℃，時(shí)間為5～20秒，退火，溫度為55℃～60℃，時(shí)間為10～60秒，30～50次循環(huán)，采集熒光。

57、在本文中，術(shù)語(yǔ)“非診斷目的”指并非旨在獲得個(gè)體是否感染上述病原體并罹患感染的信息。例如，該方法可以檢測(cè)環(huán)境、以及培養(yǎng)物中是否有上述病原體。