：本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種a型塞內(nèi)卡病毒vp2片段與大腸桿菌nissle1917鞭毛蛋白的新型嵌合蛋白的設(shè)計(jì)、誘導(dǎo)表達(dá)、純化方法以及體外生物活性驗(yàn)證。

背景技術(shù)

0、
背景技術(shù)：

1、塞內(nèi)卡病是塞內(nèi)卡病毒(senecavirusa,sva)感染引起的一種豬群新發(fā)傳染病，感染后的豬通常表現(xiàn)出沉郁、體溫升高、厭食、跛行以及蹄部和鼻吻出現(xiàn)水皰等癥狀。近年來，中國多個(gè)地區(qū)的sva疫情不斷增加，其感染仔豬導(dǎo)致死亡率升高，給養(yǎng)豬業(yè)造成了較大經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)前sva感染防控方面仍無商品化疫苗可用，且目前研究較多的滅活疫苗和減毒活疫苗也存在一些缺陷，如減毒疫苗的回毒、滅活疫苗在生產(chǎn)中存在病毒逃逸和滅活不完全的問題。而亞單位疫苗因其安全性高、免疫持久以及可通過工程菌進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)勢，成為疫苗研發(fā)的重點(diǎn)方向。研究發(fā)現(xiàn)，sva的前體蛋白p1可被3c等蛋白酶最終分解為vp1-4四種結(jié)構(gòu)蛋白，其中vp2結(jié)構(gòu)蛋白具有較佳的免疫原性，這使得以vp2為抗原設(shè)計(jì)sva亞單位疫苗成為預(yù)防sva的首選[1]。然而，vp2亞單位疫苗的制造過程中通常需要添加佐劑以提高疫苗效果且vp2單獨(dú)表達(dá)的可溶性較差，而鞭毛蛋白作為一種新型抗體佐劑，相比較于其它傳統(tǒng)的鋁膠油乳佐劑，具有在較低劑量下仍能發(fā)揮佐劑作用的優(yōu)點(diǎn)，其能夠有效誘導(dǎo)宿主的體液細(xì)胞免疫和細(xì)胞特異性免疫反應(yīng)[2]。

2、細(xì)菌鞭毛蛋白作為一種重要的病原相關(guān)分子模式(pamps)，可以通過激活機(jī)體的tlr5或nlrc4信號(hào)通路，誘導(dǎo)促炎性反應(yīng)，發(fā)揮免疫佐劑活性。目前，對鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白佐劑活性的研究廣泛開展，其免疫佐劑功效在多種病原體疫苗的研究中獲得應(yīng)用，包括鼠疫桿菌、變異鏈球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、甲型流感病毒、西尼羅河病毒和間日瘧原蟲等[3]。最近的研究還發(fā)現(xiàn)大腸桿菌nissle?1917的鞭毛蛋白具有類似的晶體結(jié)構(gòu)，可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，顯示出良好的佐劑潛力，有望成為另一種新的疫苗設(shè)計(jì)解決策略[4-5]。

3、鞭毛蛋白與抗原嵌合是構(gòu)建疫苗的優(yōu)選策略，在鞭毛蛋白的不同位置插入外源抗原，不僅能保持免疫調(diào)節(jié)功能，確?？乖c佐劑的有效遞送，提高免疫應(yīng)答，還能縮短疫苗生產(chǎn)時(shí)間并降低成本。目前，這種嵌合策略在鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白的應(yīng)用中已經(jīng)充分研究，如與瘧原蟲裂殖子表面蛋白抗原、鼠疫耶爾森氏菌f1抗原、人乳頭瘤病毒抗原等嵌合，均顯示出良好的保護(hù)效果[6]。而大腸桿菌nissle?1917的鞭毛蛋白在嵌合抗原方面的研究較為缺乏，可能由于其結(jié)構(gòu)解析還不夠清晰，機(jī)制研究尚不完善，運(yùn)用鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白的嵌合策略可能無法發(fā)揮其有效性和經(jīng)濟(jì)性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊不正確和表達(dá)效率較低等問題。因此鄧永軍的研究將大腸桿菌nissle?1917的鞭毛蛋白與抗原混合免疫，結(jié)果顯示，大腸桿菌nissle1917的鞭毛蛋白及其突變體與alvp27模式抗原混合免疫后，可以發(fā)揮佐劑效應(yīng)[5]。本發(fā)明旨在解決上述缺陷，同時(shí)探討不同嵌合形式對鞭毛蛋白佐劑效應(yīng)的影響，選用大腸桿菌nissle1917的鞭毛蛋白，與sva的vp2片段嵌合，在實(shí)施過程中意外發(fā)現(xiàn)這種嵌合形式可以解決vp2可溶性較差的問題，可溶表達(dá)產(chǎn)量顯著提高。通過體外caco2和raw264.7細(xì)胞模型的檢測，重組的新型嵌合鞭毛蛋白展現(xiàn)出良好的tlr5受體活性，能夠有效激活tlr5信號(hào)通路，同時(shí)可提高vp2的免疫原性，增強(qiáng)鞭毛蛋白疫苗的整體效力，有望應(yīng)用于塞內(nèi)卡病的預(yù)防。

4、[1]ru?y,hao?r,wu?c,li?y,lu?b,liu?h,tian?h,li?d,shi?z,luo?j,ma?k,zhangg,liu?x,zheng?h.identification?ofpotential?novel?b-cell?epitopes?ofcapsidprotein?vp2?in?senecavirusa.microbiol?spectr.2023aug?17；11(4):e0447222.doi:10.1128/spectrum.04472-22.epub?2023jul?10.pmid:37428080；pmcid:pmc10433816.

5、[2]hajam?ia,dar?pa,shahnawaz?i,jaume?jc,lee?jh.bacterial?flagellin-apotent?immunomodulatory?agent.exp?mol?med.2017sep?1；49(9):e373.doi:10.1038/emm.2017.172.pmid:28860663；pmcid:pmc5628280.

6、[3]趙靜.鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白增強(qiáng)抗體應(yīng)答的研究[d].第二軍醫(yī)大學(xué),2011.

7、[4]楊穎,鄧永軍,張進(jìn),等.益生菌大腸埃希菌nissle1917鞭毛蛋白的結(jié)構(gòu)分析及表位預(yù)測[j].中國生物制品學(xué)雜志,2022,35(06):672-677.doi:10.13200/j.cnki.cjb.003627.

8、[5]鄧永軍.益生菌nissle1917鞭毛蛋白作為新型免疫佐劑的探究[d].貴州大學(xué),2021.doi:10.27047/d.cnki.ggudu.2021.003111.

9、[6]吳文文.大腸桿菌鞭毛蛋白flic不同結(jié)構(gòu)域免疫佐劑活性的研究[d].揚(yáng)州大學(xué),2020.doi:10.27441/d.cnki.gyzdu.2020.002019.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1、本發(fā)明的第一目的為提供一種新型嵌合鞭毛蛋白。

2、本發(fā)明的第二目的為提供了新型嵌合鞭毛蛋白的制備方法。

3、本發(fā)明的第三目的為公開了一種新型嵌合鞭毛蛋白在保護(hù)動(dòng)物免受a型塞內(nèi)卡病毒感染中的應(yīng)用，為塞內(nèi)卡病毒疫苗有效性的提升和可應(yīng)用的疫苗提供了一種替代選擇。具體包括以下內(nèi)容：

4、第一方面，本發(fā)明提供了一種新型嵌合鞭毛蛋白，所述新型嵌合鞭毛蛋白由a型塞內(nèi)卡病毒vp2片段與大腸桿菌nissle?1917鞭毛蛋白嵌合而成。

5、進(jìn)一步地，所述a型塞內(nèi)卡病毒vp2片段在大腸桿菌nissle?1917鞭毛蛋白的n末端。

6、進(jìn)一步地，所述新型嵌合鞭毛蛋白由a型塞內(nèi)卡病毒vp2片段與大腸桿菌nissle1917鞭毛蛋白通過linker嵌合。

7、優(yōu)選地，所述linker的氨基酸序列為ggggsggggsggggs。

8、優(yōu)選地，所述新型嵌合鞭毛蛋白的氨基酸序列如seq?id?no：2所示。所述新型嵌合鞭毛蛋白的核苷酸序列如seq?id?no：1所示。

9、進(jìn)一步地，所述新型嵌合鞭毛蛋白在制備預(yù)防塞內(nèi)卡病毒感染疫苗中的應(yīng)用。

10、第二方面，本發(fā)明提供了一種新型嵌合鞭毛蛋白的制備方法，包括以下步驟：

11、s1：全基因合成新型嵌合鞭毛蛋白vp2-l-flic，所述新型嵌合鞭毛蛋白的核苷酸序列如seq?id?no：1所示；

12、s2：將所述新型嵌合鞭毛蛋白vp2-l-flic的核苷酸序列通過bamhi和sali酶切位點(diǎn)克隆至表達(dá)載體pet-28a(+)，構(gòu)建質(zhì)粒vp2-l-flic?in?pet-28a(+)，將重組大腸桿菌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)bl21(de3)中，獲得用于生產(chǎn)新型嵌合鞭毛蛋白的重組菌株；

13、s3：將s2步驟獲得的重組菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；

14、s4：對s3步驟獲得的菌液進(jìn)行分離純化，獲得新型嵌合鞭毛蛋白。

15、進(jìn)一步地，通過以上制備方法制備獲得新型嵌合鞭毛蛋白。

16、第三方面，本發(fā)明提供了一種新型嵌合鞭毛蛋白在制備預(yù)防塞內(nèi)卡病毒感染疫苗中的應(yīng)用。

17、本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的新型嵌合鞭毛蛋白相較于現(xiàn)有技術(shù)，展現(xiàn)出以下顯著優(yōu)勢：1)vp2片段單獨(dú)表達(dá)的可溶性較差，意外發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的新型嵌合鞭毛蛋白可以解決vp2片段包涵體表達(dá)的問題，新型嵌合鞭毛蛋白基本為可溶性表達(dá)。2)新型嵌合鞭毛蛋白的可溶性表達(dá)量約可達(dá)200mg/l。3)本發(fā)明的新型嵌合鞭毛蛋白相較于其他嵌合蛋白，體外tlr5受體活性效果較好。4)本發(fā)明的新型嵌合鞭毛蛋白可激活t淋巴細(xì)胞，提高vp2的免疫原性，增強(qiáng)鞭毛蛋白疫苗的整體效力。