本發(fā)明屬于植物基因工程領域，涉及高粱雙粒性狀基因sbdg2及其在調(diào)控雙粒高粱形成中的應用。

背景技術：

1、高粱(sorghum?bicolor(l.)moench，2n＝2x＝20)屬于禾本科高粱屬作物，是五大禾谷類作物之一，因其種質(zhì)資源豐富、光合效率高，且基因組較小(約730mb)，被用作研究禾本科c4植物的模式作物(andrew?h.paterson?et?al.(2009).the?sorghum?bicolorgenome?and?the?diversification?of?grasses.nature,457(7229),551-556)。高粱起源于非洲大陸，不僅具有高蛋白、高含糖量和高生物量的特性，而且具有耐旱、耐鹽堿、耐高溫及耐貧瘠等優(yōu)良耐逆能力，被稱作為“作物中的駱駝”。高粱具有十分廣泛的用途，除了具有重要的食用價值和營養(yǎng)價值以外，還被用作反芻動物、豬和家禽的重要飼料，還被用于生物釀造及生物能源等工業(yè)生產(chǎn)中(唐三元,謝旗.(2019).高粱——小作物大用途.生物技術通報,35(05):1)。高粱將重新成為一種重要的谷類作物，逐漸發(fā)展成為農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)增效的重要產(chǎn)業(yè)。這也必然會對高粱的產(chǎn)量和品質(zhì)提出更新、更高的要求，需要加大和加快高粱的基礎研究和實踐育種工作，以滿足高粱產(chǎn)業(yè)發(fā)展和消費市場的需要。

2、在高粱生產(chǎn)中，單位面積穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重構(gòu)成了高粱產(chǎn)量的三要素，尤其是穗粒數(shù)起著主導作用，占52％的效應，其次為千粒重，因而提高穗粒數(shù)或增加千粒重均可顯著性提高高粱的總產(chǎn)量(andrew?borrell?et?al.(1999).stay-green?trait?associatedwith?yield?in?recombinant?inbred?sorghum?lines?varying?in?rate?of?leafsenescence.international?sorghum?and?millets?newsletter.,40(40),31-34)。一般情況下，高粱的有柄小穗會敗育不結(jié)實，而無柄小穗可以正常發(fā)育為結(jié)實小穗，其中無柄小穗又包含上位花和下位花兩朵小花，下位花通常敗育而僅留一個外稃，上位花正常發(fā)育而最終產(chǎn)生一粒種子。一些特殊高粱品種表現(xiàn)出雙(復)粒性狀，即一個小穗內(nèi)產(chǎn)生兩粒或兩粒以上的種子，能夠提高穗粒數(shù)，具有提高產(chǎn)量的潛力。自1936年起就開始出現(xiàn)關于高粱雙粒性狀的報道，而通過對不同雙粒高粱材料觀察后發(fā)現(xiàn)小穗雙粒表型是由不同原因造成的：一種原因是下位花正常發(fā)育，這種雙粒性狀是受顯性位點控制的；而另一種雙?，F(xiàn)象是由上位花形成兩個雌蕊造成的(karper?r.e.(1936).floral?abnormalities?insorghum.journal?of?heredity,27(5),183-194)。盡管后續(xù)過程中國內(nèi)外出現(xiàn)一些關于高粱雙粒性狀的研究，然而關于該性狀的遺傳基礎和分子機制到目前為止仍不清楚。因此，充分挖掘和培育含有雙粒性狀的優(yōu)良新品種，并嘗試解析其分子調(diào)控機理，對于提高高粱穗粒數(shù)和高產(chǎn)育種具有重要的理論意義與應用價值。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術問題是如何促進植物小穗雙粒種子的形成。

2、為了解決上述技術問題，本發(fā)明第一方面提供了如下a1)-a3)中任一種物質(zhì)在如下e1-e4任一中的應用：

3、e1)調(diào)控植物穗粒數(shù)；

4、e2)調(diào)控植物產(chǎn)量；

5、e3)調(diào)控植物小穗花器官發(fā)育；

6、e4)調(diào)控植物小穗雙粒種子形成；

7、a1)蛋白sbdg2；

8、a2)編碼蛋白sbdg2的核酸分子；

9、a3)含有編碼蛋白sbdg2的核酸分子的重組載體、表達盒或重組菌；

10、所述蛋白sbdg2為如下b1)或b2)或b3)：

11、b1)由包括序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

12、b2)將序列表中序列4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由b1)衍生的蛋白質(zhì)；

13、b3)在b1)或b2)的n末端或/和c末端連接蛋白標簽得到的融合蛋白質(zhì)。

14、上文所述蛋白質(zhì)來源于高粱。

15、上文所述一個以上氨基酸殘基具體可為十個以內(nèi)的氨基酸殘基。

16、上述蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。

17、上述蛋白質(zhì)中，所述蛋白標簽(protein-tag)是指利用dna體外重組技術，與目的蛋白一起融合表達的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達、檢測、示蹤和/或純化。所述蛋白標簽可為flag標簽、his標簽、mbp標簽、ha標簽、myc標簽、gst標簽和/或sumo標簽等。

18、上文所述應用中，所述編碼蛋白sbdg2的核酸分子是如下c1)-c3)中任一種核酸分子：

19、c1)編碼區(qū)包括序列表中序列1或2或3所示核酸分子；

20、c2)在嚴格條件下與c1)限定的dna序列雜交且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的核酸分子；

21、c3)與c1)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的核酸分子。

22、術語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關序列之間的同一性。

23、上文中，所述核酸分子可以為dna或cdna或cds分子。

24、第二方面，本發(fā)明提供了抑制或降低第一方面中所述蛋白sbdg2活性或含量的物質(zhì)，或抑制第一方面中所述編碼蛋白sbdg2的核酸分子表達的物質(zhì)，在如下任一種的應用：

25、f1)提高植物穗粒數(shù)；

26、f2)提高植物產(chǎn)量；

27、f3)使植物小穗花器官發(fā)育異常；

28、f4)促進植物小穗雙粒種子形成。

29、上文中，使植物小穗花器官發(fā)育異常為使植物小穗的雌蕊和/或雄蕊發(fā)育異常，具體體現(xiàn)在野生型植物相比，小穗的雌蕊和/或雄蕊發(fā)育異常。

30、上文所述應用中，所述物質(zhì)為抑制所述編碼蛋白sbdg2的核酸分子表達的crisp系統(tǒng)；

31、所述crisp系統(tǒng)包括靶向sbdg2的sgrna，

32、所述sgrna的靶點為序列表1的第400-419位和/或第652-671位所示。

33、上文所述應用中，所述降物質(zhì)可為敲除所述編碼蛋白sbdg2的核酸分子的試劑，如通過同源重組敲除所述基因的試劑，或通過crispr/cas9敲除所述基因的試劑。所述抑制或降低所述基因表達的試劑可以包含靶向所述基因的多核苷酸，例如sirna、shrna、sgrna、mirna或反義rna。

34、在本發(fā)明的實施例中，所述物質(zhì)crisp系統(tǒng)，其包括pylcrispr/cas9?pubi-b-sbdg2載體，含有序列表1的第400-419位和/或第652-671位所示的sgrna的靶點。

35、第三方面，本發(fā)明提供了一種培育小穗雙粒種子轉(zhuǎn)基因植物的方法，為如下d1)或d2)：

36、d1)所述的方法包括如下步驟：降低或抑制目的植物中蛋白sbdg2的含量和/或活性，得到轉(zhuǎn)基因植物；

37、d2)所述的方法包括如下步驟：降低或抑制目的植物中編碼蛋白sbdg2的核酸分子的表達，得到轉(zhuǎn)基因植物；

38、所述轉(zhuǎn)基因植物為小穗雙粒種子植物；

39、所述蛋白sbdg2為如下b1)或b2)：

40、b1)由包括序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

41、b2)將序列表中序列4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由b1)衍生的蛋白質(zhì)。

42、第四方面，本發(fā)明提供了一種培育穗粒數(shù)提高轉(zhuǎn)基因植物的方法，為如下d1)或d2)：

43、d1)所述的方法包括如下步驟：降低或抑制目的植物中蛋白sbdg2的含量和/或活性，得到轉(zhuǎn)基因植物；

44、d2)所述的方法包括如下步驟：降低或抑制目的植物中編碼蛋白sbdg2的核酸分子的表達，得到轉(zhuǎn)基因植物；

45、所述轉(zhuǎn)基因植物的穗粒數(shù)大于所述目的植物；

46、所述蛋白sbdg2為如下b1)或b2)：

47、b1)由包括序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

48、b2)將序列表中序列4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由b1)衍生的蛋白質(zhì)。

49、第五方面，本發(fā)明提供了一種培育產(chǎn)量提高轉(zhuǎn)基因植物的方法，為如下d1)或d2)：

50、d1)所述的方法包括如下步驟：降低或抑制目的植物中蛋白sbdg2的含量和/或活性，得到轉(zhuǎn)基因植物；

51、d2)所述的方法包括如下步驟：降低或抑制目的植物中編碼蛋白sbdg2的核酸分子的表達，得到轉(zhuǎn)基因植物；

52、所述轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)量大于所述目的植物；

53、所述蛋白sbdg2為如下b1)或b2)：

54、b1)由包括序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

55、b2)將序列表中序列4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由b1)衍生的蛋白質(zhì)。

56、上文中，所述降低或抑制目的植物中蛋白sbdg2的含量和/或活性，或降低或抑制目的植物中編碼蛋白sbdg2的核酸分子的表達，可為進行如下6種調(diào)控中至少一種調(diào)控的物質(zhì)進行抑制或降低：1)在所述基因轉(zhuǎn)錄水平上進行的調(diào)控；2)在所述基因轉(zhuǎn)錄后進行的調(diào)控(也就是對所述基因的初級轉(zhuǎn)錄物的剪接或加工進行的調(diào)控)；3)對所述基因的rna轉(zhuǎn)運進行的調(diào)控(也就是對所述基因的mrna由細胞核向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運進行的調(diào)控)；4)對所述基因的翻譯進行的調(diào)控；5)對所述基因的mrna降解進行的調(diào)控；6)對所述基因的翻譯后的調(diào)控(也就是對所述基因翻譯的蛋白質(zhì)的活性進行調(diào)控)。

57、上文所述應用中，所述降低或抑制目的植物中編碼蛋白sbdg2的核酸分子的表達可通過基因敲除實現(xiàn)或通過基因沉默實現(xiàn)。

58、所述基因敲除(gene?knockout)是指通過同源重組使特定靶基因失活的現(xiàn)象?；蚯贸峭ㄟ^dna序列的改變使特定靶基因失活。

59、所述基因沉默是指在不損傷原有dna的情況下使基因不表達或低表達的現(xiàn)象。基因沉默以不改變dna序列為前提，使基因不表達或低表達?；虺聊砂l(fā)生在兩種水平上，一種是由于dna甲基化、異染色質(zhì)化以及位置效應等引起的轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默,另一種是轉(zhuǎn)錄后基因沉默，即在基因轉(zhuǎn)錄后的水平上通過對靶標rna進行特異性抑制而使基因失活，包括反義rna、共抑制(co-suppression)、基因壓抑(quelling)、rna干擾(rnai)和微小rna(mirna)介導的翻譯抑制等。

60、上文所述降低或抑制目的植物中蛋白sbdg2的含量和/或活性，或降低或抑制目的植物中編碼蛋白sbdg2的核酸分子的表達是通過將所述目的植物中上文所述蛋白質(zhì)的編碼基因敲除實現(xiàn)的。具體為向所述受體植物中導入降低或抑制上文所述蛋白編碼基因表達的物質(zhì)。

61、上文所述降低或抑制受體植物中上文所述蛋白編碼基因的表達量或上文所述蛋白質(zhì)活性或含量可采用現(xiàn)有技術中的任何方式實現(xiàn)，以使基因產(chǎn)生缺失突變、插入突變或堿基變換突變，進而實現(xiàn)基因功能降低或喪失，具體可為化學誘變、物理誘變、rnai、基因組定點編輯或同源重組等。

62、上述基因組定點編輯方法中，可采用鋅指核酸酶(zinc?finger?nuclease，zfn)技術、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應物核酸酶(transcription?activator-like?effector?nuclease，talen)技術或成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列及其相關系統(tǒng)(clustered?regularlyinterspaced?short?palindromic?repeats/crispr?associated,crispr/cas9?system)技術，以及其它能實現(xiàn)基因組定點編輯的技術。無論采取哪種方法，既可對上文所述蛋白的整個編碼基因作為靶標，又可將調(diào)控上文所述蛋白編碼基因表達的各個元件作為靶標，只要能實現(xiàn)基因功能喪失或降低即可。如可以將上文所述蛋白的編碼基因的外顯子或5’utr等作為靶標。

63、本發(fā)明通過將2份具有雙粒性狀的高粱材料(w060(pi?221608)、p034(pi533838))分別與3份表現(xiàn)為單粒性狀的高粱材料(p210(pi?613536)、p243(pi?655993)及p252(pi?656003))雜交，創(chuàng)制f1植株與f2分離群體，最后圖位克隆得到一個由單隱性位點控制的、調(diào)控高粱雙粒性狀的關鍵位點，并將其命名為dg2(double-grain?2)。dg2位點的候選基因是一個編碼mads-box蛋白的轉(zhuǎn)錄因子sbdg2(sobic.003g282400)，該編碼基因是一個負調(diào)控高粱小穗雙粒種子形成的重要因子，當其突變后能夠?qū)е聼o柄小穗的上位花異常發(fā)育，形成兩個雌蕊，進而產(chǎn)生雙粒性狀。該發(fā)明創(chuàng)新性克隆到一個控制高粱雙粒性狀的基因sbdg2，利用該編碼基因進行遺傳育種可有效提高高粱的穗粒數(shù)和生產(chǎn)產(chǎn)量。本發(fā)明所用高粱種質(zhì)資源從美國農(nóng)業(yè)部種質(zhì)資源庫引進。(參考文獻：morris?gp,ramu?p,et?al.(2013)population?genomic?and?genome-wide?association?studies?of?agroclimatic?traitsin?sorghum.proc?natl?acad?sci?usa?110:453-458；burks?ps,kaiser?cm,et?al.(2015)genome-wide?association?for?sugar?yield?in?sweet?sorghum.crop?sci?55:2138-2148.)