本發(fā)明屬于分子標(biāo)記，具體涉及一種鑒定苦蕎籽粒寬度的分子標(biāo)記、分子標(biāo)記引物組及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、苦蕎為蓼科蕎麥屬一年生雙子葉植物，是蕎麥的兩大栽培種之一?？嗍w藥食同源、生育期短、耐瘠薄、適應(yīng)性廣，是中西部等生態(tài)條件脆弱地區(qū)主要糧食作物和救災(zāi)作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有著特殊的地位。與大宗作物相比，苦蕎研究基礎(chǔ)薄弱，產(chǎn)量水平較低，嚴(yán)重制約了苦蕎產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新品種是苦蕎育種的長期目標(biāo)。我國作為苦蕎的起源地，擁有豐富的種質(zhì)資源，為優(yōu)異資源的挖掘奠定了基礎(chǔ)。

2、分子標(biāo)記是以生物個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記。隨著基因組測序技術(shù)的快速發(fā)展，以單核苷酸多態(tài)性（single?nucleotide?polymorphisms，snp）標(biāo)記為代表的第三代分子標(biāo)記技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)研究領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用于基因定位、種質(zhì)資源鑒定和分子標(biāo)記輔助育種等工作中。競爭性等位基因特異性pcr（kompetitive?allele-specific?pcr，kasp）技術(shù)可使用等位基因特異性熒光對(duì)snp標(biāo)記進(jìn)行基因分型，具有高通量，低成本，高特異性等優(yōu)勢，用途廣泛。千粒重是苦蕎產(chǎn)量的重要構(gòu)成部分，其中籽粒大小相關(guān)性狀籽粒長度和籽粒寬度與千粒重均呈顯著正相關(guān)關(guān)系。因此，開發(fā)與苦蕎籽粒大小緊密連鎖的kasp標(biāo)記可以顯著提高育種效率，對(duì)培育大粒高產(chǎn)苦蕎品種具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種鑒定苦蕎籽粒寬度的分子標(biāo)記、分子標(biāo)記引物組及其應(yīng)用，能快速篩選和鑒定寬粒苦蕎種質(zhì)資源，加快培育大粒高產(chǎn)苦蕎品種。

2、一種鑒定苦蕎籽粒寬度的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記位于苦蕎第1號(hào)染色體22,515,278bp處，且單核苷酸多態(tài)性為t/g；本發(fā)明以所述分子標(biāo)記為基礎(chǔ)，利用kasp技術(shù)進(jìn)行基因分型。

3、一種鑒定苦蕎籽粒寬度的dna片段，所述dna片段的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，其中，核苷酸序列中的k代表t/g突變。

4、一種鑒定本發(fā)明所述分子標(biāo)記或者所述dna片段的分子標(biāo)記引物組，所述分子標(biāo)記引物組包括核苷酸序列如seq?id?no.2所示的正向引物1、核苷酸序列如seq?id?no.3所示的正向引物2，核苷酸序列如seq?id?no.4所示的反向引物；且所述正向引物1的核苷酸序列的5’端包含了如seq?id?no.5所示的fam熒光標(biāo)簽序列，所述正向引物2的核苷酸序列的5’端包含了如seq?id?no.6所示的hex熒光標(biāo)簽序列。

5、優(yōu)選地，所述分子標(biāo)記引物組中，正向引物1、正向引物2、反向引物的濃度均為100μmol/l。

6、所述分子標(biāo)記引物組在苦蕎育種中的應(yīng)用。

7、所述分子標(biāo)記引物組在鑒定苦蕎籽粒寬度中的應(yīng)用。

8、優(yōu)選地，所述分子標(biāo)記引物組在鑒定苦蕎籽粒寬度中的應(yīng)用包括以下步驟：

9、（1）提取待測苦蕎種質(zhì)資源的基因組dna，調(diào)節(jié)至上機(jī)濃度；

10、（2）以調(diào)節(jié)至上機(jī)濃度的基因組dna為模板，利用所述分子標(biāo)記引物組進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；

11、（3）對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因分型檢測，當(dāng)基因分型的結(jié)果為g/g時(shí)，鑒定為寬粒苦蕎籽粒；當(dāng)基因分型的結(jié)果為g/t或者t/t時(shí)，鑒定為窄?？嗍w籽粒。

12、優(yōu)選地，所述pcr擴(kuò)增具體如下：

13、所述pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：以總反應(yīng)體積為1.6μl計(jì)，包含調(diào)節(jié)至上機(jī)濃度的基因組dna?0.8μl、2×kasp?master?mix與kasp?assay?mix混合液0.8μl，其中，所述2×kaspmaster?mix與kasp?assay?mix混合液中2×kasp?master?mix與kasp?assay?mix的體積比為1:1，所述kasp?assay?mix為分子標(biāo)記引物組；

14、所述pcr擴(kuò)增的程序?yàn)椋旱谝浑A段，預(yù)變性，94℃，15min，共1個(gè)循環(huán)；第二階段，94℃變性20sec，55~61℃退火60sec，共10個(gè)循環(huán)，每后一個(gè)循環(huán)較前一個(gè)循環(huán)溫度降低0.6℃；第三階段，94℃變性20sec，55℃退火60sec，共26個(gè)循環(huán)。

15、優(yōu)選地，所述分子標(biāo)記引物組中，正向引物1、正向引物2、反向引物的體積比為2:2:5。

16、優(yōu)選地，步驟（1）所述上機(jī)濃度為5~10ng/μl。

17、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

18、本發(fā)明開發(fā)了一種與苦蕎籽粒寬度性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，同時(shí)提供了鑒定所述分子標(biāo)記的kasp引物組，利用kasp技術(shù)、通過簡單的實(shí)驗(yàn)步驟即可對(duì)樣本完成鑒定，快速高效地篩選不同籽粒寬度的苦蕎種質(zhì)資源，提高寬?？嗍w種質(zhì)的選育效率，加快培育大粒高產(chǎn)苦蕎品種。

技術(shù)特征：

1.一種鑒定苦蕎籽粒寬度的分子標(biāo)記，其特征在于：所述分子標(biāo)記位于苦蕎第1號(hào)染色體22,515,278bp處，且單核苷酸多態(tài)性為t/g。

2.一種鑒定苦蕎籽粒寬度的dna片段，其特征在于：所述dna片段的核苷酸序列如seqid?no.1所示，其中，核苷酸序列中的k代表t/g突變。

3.一種鑒定權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記或者權(quán)利要求2所述dna片段的分子標(biāo)記引物組，其特征在于：所述分子標(biāo)記引物組包括核苷酸序列如seq?id?no.2所示的正向引物1、核苷酸序列如seq?id?no.3所示的正向引物2，核苷酸序列如seq?id?no.4所示的反向引物；且所述正向引物1的核苷酸序列的5’端包含了如seq?id?no.5所示的fam熒光標(biāo)簽序列，所述正向引物2的核苷酸序列的5’端包含了如seq?id?no.6所示的hex熒光標(biāo)簽序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子標(biāo)記引物組，其特征在于：所述分子標(biāo)記引物組中，正向引物1、正向引物2、反向引物的濃度均為100μmol/l。

5.權(quán)利要求3或4所述的分子標(biāo)記引物組在苦蕎育種中的應(yīng)用。

6.權(quán)利要求3或4所述的分子標(biāo)記引物組在鑒定苦蕎籽粒寬度中的應(yīng)用。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于：包括以下步驟：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于：所述pcr擴(kuò)增具體如下：

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述應(yīng)用，其特征在于：所述分子標(biāo)記引物組中，正向引物1、正向引物2、反向引物的體積比為2:2:5。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于：步驟（1）所述上機(jī)濃度為5~10ng/μl。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種鑒定苦蕎籽粒寬度的分子標(biāo)記、鑒定所述分子標(biāo)記的引物組及其應(yīng)用。以所述分子標(biāo)記為基礎(chǔ)，利用KASP技術(shù)，通過簡單的實(shí)驗(yàn)步驟即可對(duì)樣本完成鑒定，快速高效地篩選不同籽粒寬度的苦蕎種質(zhì)資源，提高寬粒苦蕎種質(zhì)的選育效率，加快培育大粒高產(chǎn)苦蕎品種。

技術(shù)研發(fā)人員：李境,馮佰利,楊清華,袁雨豪,韓浩坤,袁猷景,趙研博,楊璞,高金鋒,高小麗
受保護(hù)的技術(shù)使用者：延安大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9