本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種生淀粉水解酶突變體及其表達(dá)菌株和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、生淀粉水解酶指可以在淀粉的糊化溫度以下直接降解生淀粉顆粒的酶。目前，在所有已發(fā)現(xiàn)的α-淀粉酶中，具有降解生淀粉能力的α-淀粉酶大約只有10%，分布于細(xì)菌、真菌和動物中。這些α-淀粉酶可水解馬鈴薯、小麥、玉米等的生淀粉。

2、在工業(yè)應(yīng)用方面，淀粉加工工業(yè)普遍使用20-30%（w/v）的淀粉漿為原料，采用常溫酶降解生淀粉的研究得到廣泛的關(guān)注。目前以生淀粉水解酶低溫水解高濃度生淀粉的研究較少。傳統(tǒng)的淀粉制糖工藝需要兩步過程，即液化和糖化。生淀粉需要依次在100℃下糊化，在約95℃下用嗜熱α-淀粉酶液化，并在50-60℃下用葡糖淀粉酶糖化。顯然，現(xiàn)有的淀粉加工技術(shù)需要消耗大量的能量，因此有必要開發(fā)更高效、節(jié)能的工藝。生淀粉降解酶（rsde）可在淀粉糊化溫度以下直接作用于生淀粉顆粒。因此，rsde可顯著降低能源需求并簡化淀粉工藝的流程。淀粉酶的穩(wěn)定性也在淀粉制糖工藝中有著重要意義，許多淀粉酶由于其穩(wěn)定性差導(dǎo)致在水解過程中無法持續(xù)發(fā)揮水解作用。因此利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，獲得熱穩(wěn)定性較好的生淀粉水解酶對于水解高濃度玉米生淀粉制糖的應(yīng)用具有重要價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種生淀粉水解酶突變體及其表達(dá)菌株和應(yīng)用。本發(fā)明以來自南海海底沉積物細(xì)菌 pontibacillussp.zy具有高比酶活的生淀粉水解酶amyz1為基礎(chǔ)，通過分子對接確定關(guān)鍵底物結(jié)合亞位點(diǎn)，經(jīng)過定點(diǎn)突變，獲得葡萄糖產(chǎn)量提升的突變體。以大米、玉米生淀粉為底物時(shí)，突變酶產(chǎn)生葡萄糖的產(chǎn)量是出發(fā)酶的2倍；在35℃、ph7.0的條件下，其半衰期是出發(fā)酶的7.5倍。突變酶用于高濃度玉米生淀粉制糖工藝中時(shí)，液化2h后de可達(dá)36%，糖化18h后de超過99%。該突變酶在高濃度玉米生淀粉制糖工業(yè)中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

2、本發(fā)明生淀粉水解酶突變體，其氨基酸序列如seq?id?no：1所示，生淀粉水解酶的氨基酸序列第199位的亮氨酸被突變?yōu)楸奖彼帷?/p>

3、本發(fā)明生淀粉水解酶突變體的編碼基因，其核苷酸序列如seq?id?no：2所示。

4、本發(fā)明生淀粉水解酶突變體的表達(dá)菌株，分類命名為 bacillus?subtilis?wb600/pbhsss142-amyz1(l199f)，已送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心（cctcc）保藏，保藏編號為cctcc?no：m?20242140，保藏時(shí)間為2024年9月30日，保藏地址：中國·武漢·武漢大學(xué)。

5、本發(fā)明生淀粉水解酶突變體的表達(dá)菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

6、首先以來自 bacillus?licheniformis的α-淀粉酶?bla結(jié)構(gòu)為模板，利用swiss-model對生淀粉水解酶amyz1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模。用autodock對g3-g8與酶進(jìn)行分子對接。大分子小分子先進(jìn)行預(yù)處理去水、加氫、加電荷；設(shè)置264?glu為半柔性殘基；準(zhǔn)備對接參數(shù)文件將格子的大小設(shè)置為x，y，z：40，42，40，然后將格子中心設(shè)為-41.16，26.186，-6.347（x，y，z）；進(jìn)行vina對接。確定該酶最適底物為g7，因此具有七個(gè)亞位點(diǎn)。以底物還原端為正,非還原端為負(fù)進(jìn)行命名。亞位點(diǎn)分別為-5、-4、-3、-2、-1、+1、+2。根據(jù)文獻(xiàn)表明，+1位點(diǎn)上的氨基酸會影響葡萄糖產(chǎn)物生成，將+1位點(diǎn)氨基酸突變成疏水氨基酸會增加與底物間的親和力，因此選擇+1位點(diǎn)199位亮氨酸突變成苯丙氨酸。

7、根據(jù)生淀粉水解酶amyz1的基因序列，設(shè)計(jì)并合成突變引物，以含有生淀粉水解酶amyz1基因的重組質(zhì)粒為模板，以上述的合成突變引物為引物（表1），基于重疊延伸pcr的方法進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得了葡萄糖產(chǎn)物特異性生淀粉水解酶的突變基因。再通過poe-pcr的方法，將突變基因與載體pbhss142進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌 bacillus? subtiliswb600，在有卡納抗性的平板上，通過過質(zhì)粒pcr篩選條帶和測序正確的陽性克隆，得到含有本發(fā)明突變基因的工程菌株。

8、上述構(gòu)建方法中所述表達(dá)質(zhì)粒載體包括pbhss142等。

9、上述構(gòu)建方法中所述宿主菌包括 bacillus?subtiliswb600等。

10、本發(fā)明生淀粉水解酶突變體可由所述工程菌株發(fā)酵獲得。

11、本發(fā)明生淀粉水解酶突變體在淀粉水解制糖中的應(yīng)用。

12、淀粉濃度為20%-30%（w/v）。

13、所述淀粉包括大米、玉米生淀粉等。

14、以20%（w/v）大米、玉米生淀粉為底物時(shí)，本發(fā)明生淀粉水解酶突變體添加0.5u/mg，葡萄糖產(chǎn)量是出發(fā)酶的2倍；在35℃、ph7.0的條件下，半衰期是出發(fā)酶的7.5倍。本發(fā)明生淀粉水解酶突變體用在高濃度玉米生淀粉制糖工藝中，液化2h后de可達(dá)到36%；糖化18h后de超過99%。該突變酶在水解高濃度玉米生淀粉制糖為基礎(chǔ)的工業(yè)中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.一種生淀粉水解酶突變體，其氨基酸序列如seq?id?no：1所示。

2.權(quán)利要求1所述生淀粉水解酶突變體的編碼基因，其核苷酸序列如seq?id?no：2所示。

3.權(quán)利要求1所述生淀粉水解酶突變體的表達(dá)菌株，其特征在于：

4.權(quán)利要求1所述生淀粉水解酶突變體在淀粉水解制糖中的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種生淀粉水解酶突變體及其表達(dá)菌株和應(yīng)用。本發(fā)明以來自Pontibacillussp.ZY的α?淀粉酶AmyZ1為出發(fā)酶，通過分子對接確定底物結(jié)合亞位點(diǎn)，對+1位點(diǎn)199位殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得葡萄糖產(chǎn)量更高的突變酶L199F。該突變酶用在工業(yè)制糖工藝時(shí)，以玉米生淀粉為底物，液化2h后的DE值可達(dá)35%，是出發(fā)酶的1.44倍；糖化18h后DE值即可達(dá)到99%，較出發(fā)酶提前5小時(shí)。因此，該突變酶在以玉米生淀粉為底物的制糖工業(yè)領(lǐng)域具有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)研發(fā)人員：張學(xué)成,汪梓星,房偉,肖亞中
受保護(hù)的技術(shù)使用者：安徽大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6