本發(fā)明涉及生物，尤其涉及煙草nttird基因及其應用。

背景技術(shù)：

1、煙草（學名：nicotiana?tabacum?l.）是茄科煙草屬的一年生草本植物，是一種重要的經(jīng)濟作物，葉片產(chǎn)量決定了其經(jīng)濟效益。

2、二氯喹啉酸是一種除草劑，廣泛應用于稗草的去除；二氯喹啉酸大量的使用造成了對煙草生長的藥害；在煙草上的藥害一般發(fā)生在團棵期到旺長期，二氯喹啉酸脅迫導致煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量下降，影響煙葉的工業(yè)可用性和安全性。目前的解決手段主要包括開發(fā)新的對煙草不產(chǎn)生要害的除草劑或提高煙草對二氯喹啉酸的抗性。

3、通過基因工程手段提高煙草對二氯喹啉酸的抗性是行之有效的方法，因此，挖掘煙草抗性基因，在提供抗二氯喹啉酸的煙草育種領(lǐng)域具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供煙草nttird基因及其應用。

2、本發(fā)明提供了煙草tird作為靶標在植物育種中和/或制備輔助植物育種的產(chǎn)品中的應用；

3、所述煙草tird包括如下a）~c）所示氨基酸序列中的至少一種：

4、a）、如seq?id?no:2所示的氨基酸序列；或

5、b)、將如a）所述的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個氨基酸獲得的氨基酸序列，且與（a）所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或

6、c)、與如（a）或（b）所述的氨基酸序列具有至少90%序列一致性的氨基酸序列。

7、進一步的，所述植物育種包括調(diào)控植物對二氯喹啉酸的抗性；所述調(diào)控包括升高或降低。

8、更進一步的，所述植物包括十字花科、菊科、藜科、蕓香科、桑科、豆科和/或茄科植物；所述茄科植物包括煙草。

9、本發(fā)明提供了植物育種或輔助育種的產(chǎn)品，其包括如下a）~c所示中的至少一種：

10、a）、以編碼所述煙草tird的核酸為模板的擴增引物、檢測引物和/或靶向引物；

11、b）、靶向所述煙草tird的干擾片段；

12、c）、靶向所述煙草tird的grna；

13、d）、含有如b）所述干擾片段，或如c）所述grna的表達盒；

14、e）、含有如b）所述干擾片段，或如c）所述grna，或如d）所述干擾片段的重組載體；

15、f）、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染如e）所述重組載體的宿主細胞；

16、g）、培養(yǎng)如f）所述的宿主細胞獲得的混合物。

17、進一步的，本發(fā)明所述的產(chǎn)品中，所述grna的靶標核苷酸序列如seq?id?no:5所示。

18、本發(fā)明中，所述編碼煙草tird的核酸包括如下i）~v）所示的核酸中的至少一種：

19、i）、具有如seq?id?no:2所示的核苷酸序列；或

20、ii）、與如i）所示的核酸分子中的至少一個互補核酸分子；或

21、iii）、與i）或ii）的核酸分子編碼相同蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡并性而與i）或ii）的核酸分子不同的核酸分子；或

22、iv）、與i）、ii）或iii）所示的核酸分子經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的核酸分子，且與i）、ii）或iii）所示的核酸分子功能相同或相似的核酸分子；或

23、v）、與i）、ii）、iii）或iv）所述核苷酸序列具有至少80%序列一致性的核酸分子。

24、在本發(fā)明中，所述核酸可以是經(jīng)過優(yōu)化的，也可以是未經(jīng)優(yōu)化的，本發(fā)明對此不做限定，所述優(yōu)化包括但不限于：密碼子使用偏好性，消除不利于表達的二級結(jié)構(gòu)(如發(fā)夾結(jié)構(gòu))，改變gc含量，cpg二核苷酸含量，mrna的二級結(jié)構(gòu)，隱蔽剪接位點，早期多聚腺苷化位點，內(nèi)部核糖體進入位點和結(jié)合位點，負cpg島，rna不穩(wěn)定區(qū)，重復序列(直接重復、反向重復等)和可能影響克隆的限制性位點。

25、本發(fā)明中還提供了表達盒，也可稱作表達單元，所述表達單元是指啟動子開始至終止子結(jié)束的?dna序列。啟動子和終止子兩側(cè)或之間還可包括調(diào)控片段，所述調(diào)控片段可以包括與核酸序列可操作地連接的啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止信號、多腺苷酸化序列、復制起點、核酸限制性位點、和同源重組位點，例如啟動子的增強子，poly（a）信號等。

26、本發(fā)明所述的重組載體，載體種類不同，其功能及可完成的試驗目的也不相同；本發(fā)明的具體實施例中，使用克隆載體，用于擴增和分析nttird基因序列，利用crispr/cas9載體，實現(xiàn)nttird基因功能的缺失；本發(fā)明中，含有所述grna的crispr/cas9載體在nttird基因62bp和63bp之間插入一個堿基a，造成移碼突變，是基因功能缺失。

27、本發(fā)明提供了試劑盒，其包括本發(fā)明所述的產(chǎn)品和輔料。

28、進一步的，所述輔料用于協(xié)助所述產(chǎn)品發(fā)揮作用或維持所述產(chǎn)品的活性或用于保存所述產(chǎn)品，本發(fā)明對此不做限定；本發(fā)明中，所述輔料包括：dna提取試劑、培養(yǎng)基、dna反轉(zhuǎn)錄試劑、抗生素和/或緩沖液中的至少一種。

29、本發(fā)明提供了所述的產(chǎn)品或所述的試劑盒在植物育種或輔助植物育種中的應用。

30、本發(fā)明提供了植物育種或輔助植物育種的方法，其包括利用本發(fā)明所述的產(chǎn)品或本發(fā)明所述的試劑盒進行植物育種。

31、本發(fā)明經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)：nttird基因功能缺失突變株對二氯喹啉酸藥害抗性增加，從而消除或者減輕藥害對煙葉生產(chǎn)造成的損失；因此，本發(fā)明第一次揭示了nttird基因可應用于調(diào)控植株對二氯喹啉酸藥害的抗性中，為煙草育種獲得優(yōu)勢植株提供了新的思路。

技術(shù)特征：

1.煙草tird作為靶標在植物育種中和/或制備輔助植物育種的產(chǎn)品中的應用；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，所述植物育種包括調(diào)控植物對二氯喹啉酸的抗性。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述調(diào)控包括升高或降低。

4.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項所述的應用，其特征在于，所述植物包括十字花科、菊科、藜科、蕓香科、桑科、豆科和/或茄科植物；所述茄科植物包括煙草。

5.植物育種或輔助育種的產(chǎn)品，其特征在于，包括如下a）~c所示中的至少一種：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述grna的靶標核苷酸序列如seq?id?no:5所示。

7.試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求5或6所述的產(chǎn)品和輔料。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述輔料包括：dna提取試劑、培養(yǎng)基、dna反轉(zhuǎn)錄試劑、抗生素和/或緩沖液中的至少一種。

9.權(quán)利要求5或6所述的產(chǎn)品或權(quán)利要求7或8所述的試劑盒在植物育種或輔助植物育種中的應用。

10.植物育種或輔助植物育種的方法，其特征在于，包括利用權(quán)利要求5或6所述的產(chǎn)品或權(quán)利要求7或8所述的試劑盒進行植物育種。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及煙草NtTIRd基因及其應用。本發(fā)明經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)：NtTIRd基因功能缺失突變株對二氯喹啉酸藥害抗性增加，從而消除或者減輕藥害對煙葉生產(chǎn)造成的損失；因此，本發(fā)明第一次揭示了NtTIRd基因可應用于調(diào)控植株對二氯喹啉酸藥害的抗性中，為煙草育種獲得優(yōu)勢植株提供了新的思路。

技術(shù)研發(fā)人員：高軍平,馬畛,陳凱,楊影,謝圣林,王帥斌,何鑫璽,李曉旭,張新要,黃平俊
受保護的技術(shù)使用者：湖南中煙工業(yè)有限責任公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2