本發(fā)明涉及生物，尤其涉及煙草ntd27基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、煙草是一種廣泛種植且經(jīng)濟(jì)效益較高的作物。合理的打頂抹杈是提升煙葉質(zhì)量的關(guān)鍵農(nóng)藝措施之一。打頂技術(shù)雖已廣泛應(yīng)用，但控制打頂后腋芽的生長(zhǎng)仍是提高煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)的重要挑戰(zhàn)?，F(xiàn)有的抹杈方法主要分為人工和藥物抹杈，前者耗時(shí)費(fèi)力，且反復(fù)操作易引發(fā)病害，后者雖對(duì)煙株損傷較小，但可能影響煙葉品質(zhì)，污染環(huán)境且成本較高。而有效的腋芽生長(zhǎng)控制手段是綠色煙葉生產(chǎn)的一個(gè)重要目標(biāo)。因此，尋找控制煙草調(diào)控?zé)煵菀秆可L(zhǎng)的調(diào)控基因，以基因工程手段，獲得遺傳改良的煙草植株具有重要的實(shí)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供煙草ntd27基因及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明中，煙草ntd27基因，其基因編碼產(chǎn)物經(jīng)生物信息學(xué)分析為煙草β-胡蘿卜素異構(gòu)酶。

3、本發(fā)明提供了煙草β-胡蘿卜素異構(gòu)酶作為靶標(biāo)在調(diào)控植物葉芽數(shù)量和/或分枝數(shù)量中的應(yīng)用。

4、進(jìn)一步的，

5、所述煙草β-胡蘿卜素異構(gòu)酶的氨基酸序列如seq?id?no:2所示。

6、所述調(diào)控包括升高和/或降低。

7、本發(fā)明所述植物包括十字花科、菊科、藜科、蕓香科、?？?、豆科和/或茄科植物；進(jìn)一步的，所述茄科植物包括煙草。

8、本發(fā)明提供了植物育種或輔助育種的產(chǎn)品，其包括如下a）~c所示中的至少一種：

9、a）、以編碼所述煙草β-胡蘿卜素異構(gòu)酶的核酸為模板的擴(kuò)增引物、檢測(cè)引物和/或靶向引物；

10、b）、靶向所述煙草β-胡蘿卜素異構(gòu)酶的干擾片段；

11、c）、靶向所述煙草β-胡蘿卜素異構(gòu)酶的grna；

12、d）、含有如b）所述干擾片段，或如c）所述grna的表達(dá)盒；

13、e）、含有如b）所述干擾片段，或如c）所述grna，或如d）所述干擾片段的重組載體；

14、f）、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染如e）所述重組載體的宿主細(xì)胞；

15、g）、培養(yǎng)如f）所述的宿主細(xì)胞獲得的混合物。

16、本發(fā)明提供了grna片段，grna片段為靶向目標(biāo)基因的位于crispr/核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)（如crispr/cas9、crispr/cas12a、crispr/cas12b、crispr/cas13a和crispr/cas14a）編輯系統(tǒng)識(shí)別位點(diǎn)（pam位點(diǎn)）前20bp左右的片段；所述crispr/核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)編輯系統(tǒng)識(shí)別位點(diǎn)根據(jù)核酸內(nèi)切酶的不同而產(chǎn)生區(qū)別，通常的，所述識(shí)別位點(diǎn)包括ngg（cas9）和/或ttn（cpf1）等；本發(fā)明的具體實(shí)施例中，利用crispr/cas9系統(tǒng)，其識(shí)別位點(diǎn)為ngg，所述n代表a、t、c或g堿基種的任意一種，所述grna的靶位點(diǎn)的位置可以在所述編碼煙草β-胡蘿卜素異構(gòu)酶的核酸的5’端、中間或3’端的任意位置，本發(fā)明對(duì)此不作限定；本發(fā)明中，以煙草β-胡蘿卜素異構(gòu)酶為靶標(biāo)，利用crispr/cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯，具體的，所述grna片段的靶區(qū)段的核苷酸序列如seq?id?no:7所示；

17、進(jìn)一步的，本發(fā)明中，經(jīng)crispr/cas9系統(tǒng)基因編輯后獲得了煙草β-胡蘿卜素異構(gòu)酶，其在seq?id?no:1所示核苷酸序列的271bp處的堿基a缺失，產(chǎn)生移碼突變，導(dǎo)致煙草β-胡蘿卜素異構(gòu)酶功能的喪失和/或降低。

18、本發(fā)明所述表達(dá)盒是指啟動(dòng)子開始至終止子結(jié)束的?dna序列。啟動(dòng)子和終止子兩側(cè)或之間還可包括調(diào)控片段，所述調(diào)控片段可以包括與核酸序列可操作地連接的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、多腺苷酸化序列、復(fù)制起點(diǎn)、核酸限制性位點(diǎn)、和同源重組位點(diǎn)，例如啟動(dòng)子的增強(qiáng)子，poly（a）信號(hào)等。

19、本發(fā)明所述重組載體，是指重組的核酸載體，是一種重組dna分子，其包含期望的編碼序列和對(duì)可操作連接的編碼基因在具體宿主生物內(nèi)的表達(dá)或完成對(duì)目的操作所必不可少的合適的核酸序列或元件。

20、在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”有時(shí)可以交換通用，因?yàn)橘|(zhì)粒是當(dāng)前最普遍使用的載體形式。然而，本發(fā)明意圖包括表達(dá)載體的這樣的其它形式，其發(fā)揮等價(jià)作用，其在本領(lǐng)域是已知的或?qū)⒆優(yōu)橐阎?，包括但不限于：質(zhì)粒，噬菌體顆粒，病毒載體和/或僅為潛在的基因組插入物。

21、本發(fā)明所述宿主細(xì)胞包括植物細(xì)胞，所述植物包括十字花科、菊科、藜科、蕓香科、?？?、豆科或茄科植物，進(jìn)一步的，本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述植物為茄科植物，進(jìn)一步的，所述茄科植物為煙草。

22、本發(fā)明提供了試劑盒，其包括本發(fā)明所述的產(chǎn)品和輔料。

23、所述輔料用于保存、生物復(fù)制所述產(chǎn)品，或協(xié)助所述產(chǎn)品發(fā)揮作用；本發(fā)明中，所述輔料包括：dna提取試劑、dntp、dna反轉(zhuǎn)錄試劑、培養(yǎng)基、抗生素和/或緩沖液中的至少一種。

24、本發(fā)明提供了所述的產(chǎn)品或所述的試劑盒在植物育種或輔助植物育種中的應(yīng)用。

25、本發(fā)明提供了植物育種或輔助植物育種的方法，其包括利用本發(fā)明所述的產(chǎn)品或本發(fā)明所述的試劑盒進(jìn)行植物育種。

26、本申請(qǐng)通過對(duì)ntd27基因的研究，發(fā)現(xiàn)該基因影響煙草腋芽的發(fā)育。通過ntd27基因的敲除突變，能夠促進(jìn)煙草腋芽的生長(zhǎng)，ntd27基因的過表達(dá)，能夠有效抑制煙草腋芽的生長(zhǎng)；為煙草少腋芽的分子育種提供了潛在的種質(zhì)資源支持，在煙草重要性狀的遺傳改良和植物學(xué)基礎(chǔ)研究中均具有重要的實(shí)用價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.煙草β-胡蘿卜素異構(gòu)酶作為靶標(biāo)在調(diào)控植物葉芽數(shù)量和/或分枝數(shù)量中的應(yīng)用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述煙草β-胡蘿卜素異構(gòu)酶的氨基酸序列如seq?id?no:2所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述調(diào)控包括升高和/或降低。

4.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物包括煙草。

5.植物育種或輔助育種的產(chǎn)品，其特征在于，包括如下a）~c所示中的至少一種：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述grna的靶標(biāo)區(qū)域的核苷酸序列如seqid?no:7所示。

7.試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求5或6所述的產(chǎn)品和輔料。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述輔料包括：dna提取試劑、dntp、dna反轉(zhuǎn)錄試劑、培養(yǎng)基、抗生素和/或緩沖液中的至少一種。

9.權(quán)利要求5或6所述的產(chǎn)品或權(quán)利要求7或8所述的試劑盒在植物育種或輔助植物育種中的應(yīng)用。

10.植物育種或輔助植物育種的方法，其特征在于，包括利用權(quán)利要求5或6所述的產(chǎn)品或權(quán)利要求7或8所述的試劑盒進(jìn)行植物育種。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及煙草NtD27基因及其應(yīng)用。本申請(qǐng)通過對(duì)NtD27基因的研究，發(fā)現(xiàn)該基因影響煙草腋芽的發(fā)育。通過NtD27基因的敲除突變，能夠促進(jìn)煙草腋芽的生長(zhǎng)，NtD27基因的過表達(dá)，能夠有效抑制煙草腋芽的生長(zhǎng)；為煙草少腋芽的分子育種提供了潛在的種質(zhì)資源支持，在煙草重要性狀的遺傳改良和植物學(xué)基礎(chǔ)研究中均具有重要的實(shí)用價(jià)值。

技術(shù)研發(fā)人員：王帥斌,高軍平,楊小年,陳凱,韓志偉,黃平俊,何鑫璽,張新要
受保護(hù)的技術(shù)使用者：湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2