本發(fā)明涉及生物，尤其涉及煙草ntacs3基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、煙草是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，煙葉是卷葉工業(yè)的基本原料，煙葉質(zhì)量決定了其工業(yè)可用性。

2、二氯喹啉酸是主要用于防除稻田稗草，是我國(guó)稻田芽前苗后的主要除草劑品種，目前由于長(zhǎng)期大量的使用，在我國(guó)部分地區(qū)已經(jīng)陸續(xù)發(fā)生二氯喹啉酸藥害，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。二氯喹啉酸積累造成煙草葉片卷曲畸形，使煙葉產(chǎn)量大幅度下降甚至絕收；同時(shí)導(dǎo)致煙葉煙堿含量上升，還原糖含量下降，影響煙草品質(zhì)，進(jìn)一步影響煙葉的工業(yè)可用性和安全性。

3、可見，提高煙草對(duì)二氯喹啉酸抗性或減少二氯喹啉酸藥物的使用迫在眉睫；但目前二氯喹啉酸已經(jīng)在土壤中大量積累，因此進(jìn)行煙草育種，提高煙草對(duì)二氯喹啉酸抗性，是解決煙草二氯喹啉酸藥害的主要手段。所以，挖掘二氯喹啉酸抗性基因，利用基因工程手段，將其應(yīng)用于煙草育種，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供煙草ntacs3基因及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明提供了acs3作為靶標(biāo)在植物育種中和/或制備輔助植物育種的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

3、本發(fā)明所述的應(yīng)用中，所述acs3包括如下a）~c）所示氨基酸序列中的至少一種：

4、a）、如seq?id?no:2所示的氨基酸序列；或

5、b)、將如a）所述的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸獲得的氨基酸序列，且與（a）所述的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列；或

6、c)、與如（a）或（b）所述的氨基酸序列具有至少90%序列一致性的氨基酸序列。

7、進(jìn)一步的，

8、所述植物育種包括調(diào)控植物對(duì)二氯喹啉酸的抗性；

9、所述調(diào)控包括升高或降低；所述降低包括功能部分喪失或功能全部喪失；本發(fā)明的具體實(shí)施例中，acs3功能全部喪失，植物對(duì)二氯喹啉酸的抗性增強(qiáng)。

10、所述植物茄科植物；本發(fā)明的具體實(shí)施例中，為煙草。

11、本發(fā)明提供了植物育種或輔助育種的產(chǎn)品，其包括如下a）~c所示中的至少一種：

12、a）、以編碼所述acs3的核酸為模板的擴(kuò)增引物、檢測(cè)引物和/或靶向引物；

13、b）、靶向所述acs3的干擾片段；

14、c）、靶向所述acs3的grna；

15、d）、含有如b）所述干擾片段，或如c）所述grna的表達(dá)盒；

16、e）、含有如b）所述干擾片段，或如c）所述grna，或如d）所述干擾片段的重組載體；

17、f）、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染如e）所述重組載體的宿主細(xì)胞；

18、g）、培養(yǎng)如f）所述的宿主細(xì)胞獲得的混合物。

19、進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的產(chǎn)品中，

20、所述grna的靶標(biāo)核苷酸序列如seq?id?no:9所示；本發(fā)明中，將所述grna重組于crispr/cas9載體，其靶標(biāo)核苷酸序列如seq?id?no:9所示；然后轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)crispr/cas9系統(tǒng)基因編輯后獲得了煙草acs3變體，其在如seq?id?no:1所示核苷酸序列的第374和375bp之間插入一個(gè)堿基a，產(chǎn)生移碼突變，導(dǎo)致煙草acs3功能的喪失和/或降低。

21、編碼所述acs3的核酸包括如下i）~v）所示的核酸中的至少一種：

22、i）、具有如seq?id?no:1所示的核苷酸序列；或

23、ii）、與如i）所示的核酸分子中的至少一個(gè)互補(bǔ)核酸分子；或

24、iii）、與i）或ii）的核酸分子編碼相同蛋白質(zhì)，但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而與i）或ii）的核酸分子不同的核酸分子；或

25、iv）、與i）、ii）或iii）所示的核酸分子經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)堿基獲得的核酸分子，且與i）、ii）或iii）所示的核酸分子功能相同或相似的核酸分子；或

26、v）、與i）、ii）、iii）或iv）所述核苷酸序列具有至少80%序列一致性的核酸分子。

27、本發(fā)明所述核酸，其可以是dna、rna或cdna。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述核酸為dna或rna形式。所述dna形式包括cdna、基因組dna或人工合成的dna。所述dna可以是單鏈的或是雙鏈的；本發(fā)明對(duì)此不作限定。

28、本發(fā)明所述表達(dá)盒是指啟動(dòng)子開始至終止子結(jié)束的?dna序列。啟動(dòng)子和終止子兩側(cè)或之間還可包括調(diào)控片段，所述調(diào)控片段可以包括與核酸序列可操作地連接的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、多腺苷酸化序列、復(fù)制起點(diǎn)、核酸限制性位點(diǎn)、和同源重組位點(diǎn)，例如啟動(dòng)子的增強(qiáng)子，poly（a）信號(hào)等。

29、本發(fā)明所述的重組載體為重組dna分子，其包含期望的編碼序列和對(duì)可操作連接的編碼基因在具體宿主生物內(nèi)的表達(dá)、復(fù)制或完成對(duì)目的操作所必不可少的合適的核酸序列或元件；本發(fā)明中，所述重組載體包括克隆載體、表達(dá)載體或行使功能干擾或功能缺失的載體；本發(fā)明的具體實(shí)施例中，包括克隆載體，其用于所述acs3基因的克隆和基因序列分析；本發(fā)明的另一些具體的實(shí)施例中，包括使功能缺失的crispr/cas9載體；根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?，選擇合適的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人源所采取的常規(guī)手段，本發(fā)明對(duì)此不作贅述。

30、在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”有時(shí)可以交換通用，因?yàn)橘|(zhì)粒是當(dāng)前最普遍使用的載體形式。然而，本發(fā)明意圖包括表達(dá)載體的這樣的其它形式，其發(fā)揮等價(jià)作用，其在本領(lǐng)域是已知的或?qū)⒆優(yōu)橐阎?，包括但不限于：質(zhì)粒，噬菌體顆粒，病毒載體和/或僅為潛在的基因組插入物。

31、本發(fā)明中，所述轉(zhuǎn)化的方法包括：化學(xué)轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)化；所述轉(zhuǎn)染的方法包括磷酸鈣共沉淀、人工脂質(zhì)體法、病毒轉(zhuǎn)染或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。所述的病毒轉(zhuǎn)染包括腺病毒轉(zhuǎn)染、腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染、慢病毒轉(zhuǎn)染等。本發(fā)明的具體實(shí)施粒中，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法制備acs3基因功能缺失突變株用于acs3基因功能的研究。

32、本發(fā)明提供了試劑盒，其包括輔料和本發(fā)明所述的產(chǎn)品。

33、所述輔料用于保存所述產(chǎn)品、維持所述產(chǎn)品的活性、或輔助所述產(chǎn)品發(fā)揮作用，完成相應(yīng)的功能；本發(fā)明中，所述輔料包括：dna提取試劑、dna反轉(zhuǎn)錄試劑、緩沖液、轉(zhuǎn)染試劑、抗生素和/或培養(yǎng)基中的至少一種。

34、本發(fā)明提供了所述的產(chǎn)品或所述的試劑盒在植物育種或輔助植物育種中的應(yīng)用。

35、本發(fā)明提供了植物育種或輔助植物育種的方法，其包括利用本發(fā)明所述的產(chǎn)品或本發(fā)明所述的試劑盒進(jìn)行植物育種。

36、本發(fā)明提供了煙草ntacs3基因在提高煙草對(duì)二氯喹啉酸抗性中的應(yīng)用。敲除煙草ntacs3基因，能夠賦予煙草對(duì)二氯喹啉酸的抗性，從而消除或者減輕藥害給煙葉生產(chǎn)造成的損失。

技術(shù)特征：

1.acs3作為靶標(biāo)在植物育種中和/或制備輔助植物育種的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物育種包括調(diào)控植物對(duì)二氯喹啉酸的抗性。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述調(diào)控包括升高或降低。

4.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物茄科植物。

5.植物育種或輔助育種的產(chǎn)品，其特征在于，包括如下a）~c所示中的至少一種：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于，

7.試劑盒，其特征在于，包括輔料和權(quán)利要求5或6所述的產(chǎn)品。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述輔料包括：dna提取試劑、dna反轉(zhuǎn)錄試劑、緩沖液、轉(zhuǎn)染試劑、抗生素和/或培養(yǎng)基中的至少一種。

9.權(quán)利要求5或6所述的產(chǎn)品或權(quán)利要求7或8所述的試劑盒在植物育種或輔助植物育種中的應(yīng)用。

10.植物育種或輔助植物育種的方法，其特征在于，包括利用權(quán)利要求5或6所述的產(chǎn)品或權(quán)利要求7或8所述的試劑盒進(jìn)行植物育種。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及煙草NtACS3基因及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了煙草NtACS3基因在提高煙草對(duì)二氯喹啉酸抗性中的應(yīng)用。敲除煙草NtACS3基因，能夠賦予煙草對(duì)二氯喹啉酸的抗性，從而消除或者減輕藥害給煙葉生產(chǎn)造成的損失。

技術(shù)研發(fā)人員：張新要,高軍平,王東,楊小年,何鑫璽,陳凱,韓志偉,黃平俊,王帥斌,蒲文宣,李曉旭
受保護(hù)的技術(shù)使用者：湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2