本發(fā)明涉及生物，尤其涉及煙草nttl17l基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、煙草是我國重要的經(jīng)濟作物，提高煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)是煙草育種的重要方向。煙草色素的含量與煙草生長發(fā)育過程代謝積累特性和調(diào)制方法密切相關(guān)。葉綠素是綠色植物進行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，葉綠素含量是衡量植物光合作用、營養(yǎng)狀況和生長態(tài)勢的重要指標，煙葉中的葉綠素的含量和性質(zhì)不僅影響外觀質(zhì)量，也直接和間接地影響煙葉的內(nèi)在品質(zhì)。

2、因此挖掘和利用煙草葉綠素合成基因，研究葉綠素合成和分解代謝機制，創(chuàng)制不同葉綠素含量的煙草素材，可以更好的理解煙草的生長發(fā)育調(diào)控過程,?也能夠為煙草品種的遺傳改良和煙葉生產(chǎn)的產(chǎn)量提高提供理論依據(jù)和素材資源，具有較為重要的科學研究與實用價值。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供煙草nttl17l基因及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明提供了煙草tl17l作為靶標在植物育種和/或輔助植物育種中的應(yīng)用；

3、所述煙草tl17l的氨基酸序列如seq?id?no:2所示。

4、進一步的，所述植物育種包括：

5、調(diào)控植物細胞色素含量；和/或

6、調(diào)控植物次級代謝產(chǎn)物；和/或

7、調(diào)控植物鹽耐受能力；和/或

8、調(diào)控植物耐干旱能力。

9、所述細胞色素包括：新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、葉黃質(zhì)、葉綠素a、葉綠素b、β-胡蘿卜素；

10、所述代謝產(chǎn)物包括綠原酸；

11、更進一步的，所述調(diào)控包括升高和/或降低。

12、包括十字花科、菊科、藜科、蕓香科、桑科、豆科和/或茄科植物；進一步的，所述茄科植物包括煙草。

13、本發(fā)明提供了植物育種或輔助育種的產(chǎn)品，其包括如下a）~c所示中的至少一種：

14、a）、以編碼所述煙草tl17l的核酸為模板的擴增引物、檢測引物和/或靶向引物；

15、b）、靶向所述煙草tl17l的干擾片段；

16、c）、靶向所述煙草tl17l的grna；

17、d）、含有如b）所述干擾片段，或如c）所述grna的表達盒；

18、e）、含有如b）所述干擾片段，或如c）所述grna，或如d）所述干擾片段的重組載體；

19、f）、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染如e）所述重組載體的宿主細胞；

20、g）、培養(yǎng)如f）所述的宿主細胞獲得的混合物。

21、本發(fā)明中，所述的核酸包括dna或rna，其可以是如seq?id?no:1所示的核苷酸序列；也可以是如seq?id?no:1所示的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-rna；其根據(jù)實驗目的不同對一次具體的實驗中使用的模板或靶標為dna還是rna進行選?。槐景l(fā)明中，所述dna形式包括cdna、基因組dna或人工合成的dna。所述dna可以是單鏈的或是雙鏈的。核酸可以包括具有不同功能的核苷酸序列，如編碼區(qū)和非編碼區(qū)如調(diào)控序列（例如啟動子或轉(zhuǎn)錄終止子）。核酸在拓撲學上可以是線性或環(huán)狀的。核酸可直接從天然來源獲得，或者可由重組、酶法或化學技術(shù)輔助制備。

22、本發(fā)明提供了grna片段，grna片段為靶向目標基因的位于crispr/核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)（如crispr/cas9、crispr/cas12a、crispr/cas12b、crispr/cas13a和crispr/cas14a）編輯系統(tǒng)識別位點（pam位點）前20bp左右的片段；所述crispr/核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)編輯系統(tǒng)識別位點根據(jù)核酸內(nèi)切酶的不同而產(chǎn)生區(qū)別，通常的，所述識別位點包括ngg（cas9）和/或ttn（cpf1）等；本發(fā)明的具體實施例中，利用crispr/cas9系統(tǒng)，其識別位點為ngg，所述n代表a、t、c或g堿基種的任意一種，所述ngg的位置可以在所述編碼煙草煙草tl17l的核酸的5’端、中間或3’端的任意位置，本發(fā)明對此不作限定；本發(fā)明中，以煙草tl17l為靶標，利用crispr/cas9系統(tǒng)進行基因編輯，具體的，所述grna片段的靶區(qū)段的核苷酸序列如seq?idno:7所示；

23、進一步的，本發(fā)明中，經(jīng)crispr/cas9系統(tǒng)基因編輯后獲得了煙草tl17l突變株，所述突變株在seq?id?no:1所示核苷酸序列的167~168bp區(qū)域插入一個堿基a缺失，產(chǎn)生移碼突變，導致煙草tl17l功能的喪失。煙草tl17l功能喪失的突變株新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、葉黃質(zhì)、葉綠素a、葉綠素b、β-胡蘿卜素含量升高，綠原酸含量降低，抗旱性和耐鹽性能力增加。

24、本發(fā)明所述的重組載體為重組dna分子，其包含期望的編碼序列和對可操作連接的編碼基因在具體宿主生物內(nèi)的表達、復制或完成對目的操作所必不可少的合適的核酸序列或元件；本發(fā)明中，所述重組載體包括克隆載體、表達載體或行使功能干擾或功能缺失的載體；本發(fā)明的具體實施例中，包括克隆載體，其用于所述tl17l基因的克隆和基因序列分析；本發(fā)明的另一些具體的實施例中，包括使功能缺失的crispr/cas9載體；根據(jù)實驗目的的不同，選擇合適的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人源所采取的常規(guī)手段，本發(fā)明對此不作贅述。

25、在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”有時可以交換通用，因為質(zhì)粒是當前最普遍使用的載體形式。然而，本發(fā)明意圖包括表達載體的這樣的其它形式，其發(fā)揮等價作用，其在本領(lǐng)域是已知的或?qū)⒆優(yōu)橐阎?，包括但不限于：質(zhì)粒，噬菌體顆粒，病毒載體和/或僅為潛在的基因組插入物。

26、本發(fā)明中，所述轉(zhuǎn)化的方法包括：化學轉(zhuǎn)化和電轉(zhuǎn)化；所述轉(zhuǎn)染的方法包括磷酸鈣共沉淀、人工脂質(zhì)體法、病毒轉(zhuǎn)染或農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)染。所述的病毒轉(zhuǎn)染包括腺病毒轉(zhuǎn)染、腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染、慢病毒轉(zhuǎn)染等。本發(fā)明的具體實施粒中，采用農(nóng)桿菌介導的葉盤法制備tl17l基因功能缺失突變株用于tl17l基因功能的研究。

27、本發(fā)明提供了試劑盒，其包括本發(fā)明所述的產(chǎn)品和輔料。

28、進一步的，所述輔料包括：dna提取試劑、dntp、dna反轉(zhuǎn)錄試劑、培養(yǎng)基、抗生素和/或緩沖液中的至少一種。

29、本發(fā)明提供了所述的產(chǎn)品或所述的試劑盒在植物育種或輔助植物育種中的應(yīng)用。

30、本發(fā)明提供了植物育種或輔助植物育種的方法，其包括本發(fā)明所述的產(chǎn)品或本發(fā)明所述的試劑盒進行植物育種。

31、本發(fā)明試驗發(fā)現(xiàn)，nttl17l基因功能缺失突變株葉片中的葉綠素b、葉黃質(zhì)、紫黃質(zhì)的含量升高，綠原酸的含量降低，抗旱性和耐鹽性增加，對于煙草光合作用的調(diào)控、次生代謝和提高煙葉產(chǎn)量有著重要的理論和應(yīng)用意義，為煙草育種提供了新思路。

技術(shù)特征：

1.煙草tl17l作為靶標在植物育種和/或輔助植物育種中的應(yīng)用；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物育種包括：

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述調(diào)控包括升高和/或降低。

4.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物包括煙草。

5.植物育種或輔助育種的產(chǎn)品，其特征在于，包括如下a）~c所示中的至少一種：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述grna的靶標區(qū)域的核苷酸序列如seqid?no:7所示。

7.試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求5或6所述的產(chǎn)品和輔料。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述輔料包括：dna提取試劑、dntp、dna反轉(zhuǎn)錄試劑、培養(yǎng)基、抗生素和/或緩沖液中的至少一種。

9.權(quán)利要求5或6所述的產(chǎn)品或權(quán)利要求7或8所述的試劑盒在植物育種或輔助植物育種中的應(yīng)用。

10.植物育種或輔助植物育種的方法，其特征在于，包括利用權(quán)利要求5或6所述的產(chǎn)品或權(quán)利要求7或8所述的試劑盒進行植物育種。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及煙草NtTL17L基因及其應(yīng)用。本發(fā)明試驗發(fā)現(xiàn)，NtTL17L基因功能缺失突變株葉片中的葉綠素b、葉黃質(zhì)、紫黃質(zhì)的含量升高，綠原酸的含量降低，抗旱性和耐鹽性增加，對于煙草光合作用的調(diào)控、次生代謝和提高煙葉產(chǎn)量有著重要的理論和應(yīng)用意義，為煙草育種提供了新思路。

技術(shù)研發(fā)人員：高軍平,王東,吳榆,何鑫璽,陳龍,韓志偉,王帥斌,蒲文宣,張新要,李曉旭,黃平俊,楊小年
受保護的技術(shù)使用者：湖南中煙工業(yè)有限責任公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2