本發(fā)明屬于體外檢測(cè)，具體涉及一種高危型hpv一鍋法檢測(cè)凍干試劑、試劑盒及其用途。

背景技術(shù)：

1、宮頸癌是全球女性面臨的第四大惡性腫瘤，消除宮頸癌勢(shì)在必行。目前已明確高危型hpv感染是誘發(fā)外生殖器癌、宮頸癌及高度子宮頸上皮內(nèi)瘤變的病因。但是hpv持續(xù)感染到宮頸癌前病變，并最終發(fā)展為宮頸癌，通常需要8至10年的時(shí)間。因此，提高篩查覆蓋率，采用高質(zhì)量的篩查方法，是消除宮頸癌的關(guān)鍵手段。

2、高危hpv有14型，核酸檢測(cè)分型為who推薦宮頸癌初篩方法。但廣泛使用的pcr法需昂貴設(shè)備、特殊條件和熟練人員，不利條件有限地區(qū)。另外，hpv感染者需持續(xù)監(jiān)測(cè)治療情況，14型別多次重復(fù)檢測(cè)，浪費(fèi)大量醫(yī)療資源，故亟需開發(fā)便捷、居家、有針對(duì)性的hpv新檢測(cè)方法。rpa為高效恒溫?cái)U(kuò)增法，適于大規(guī)模篩查和資源匱乏區(qū)，但非特異性產(chǎn)物影響其應(yīng)用。crispr/cas12a通過(guò)精確配對(duì)和高效切割能增強(qiáng)rpa結(jié)果。兩者結(jié)合有望替代pcr，成為快速、居家、高效的宮頸癌初篩手段。

3、然而，常規(guī)的rpa與crispr檢測(cè)試劑需低溫保存、運(yùn)輸，并且反復(fù)凍融會(huì)影響性能的穩(wěn)定。因此，開發(fā)常溫下穩(wěn)定保存、便于運(yùn)輸?shù)脑噭┲陵P(guān)重要。將檢測(cè)試劑制備成為凍干試劑是解決上述問(wèn)題的可行思路。然而，rpa與crispr檢測(cè)試劑是一種成分復(fù)雜的組合物，特別是凍干的rpa試劑與凍干的crispr試劑再反應(yīng)過(guò)程中會(huì)混合為一個(gè)體系，其成分進(jìn)一步復(fù)雜化，包含dna、rna和酶、凍干成分等物質(zhì)。因而，在開發(fā)具體的檢測(cè)試劑過(guò)程中，如何改進(jìn)凍干試劑的組成，特別是如何設(shè)置凍干保護(hù)劑的組成，進(jìn)而保證檢測(cè)試劑的穩(wěn)定性，避免其性能降低，這是一個(gè)重要的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種高危型hpv一鍋法檢測(cè)凍干試劑、試劑盒及其用途。

2、一種高危型hpv一鍋法檢測(cè)凍干試劑，它包括rpa凍干試劑和/或crispr/cas12a檢測(cè)體系凍干試劑；

3、所述rpa凍干試劑是由rpa擴(kuò)增體系制成的凍干試劑，所述rpa擴(kuò)增體系包括如下組分：

4、rpa恒溫?cái)U(kuò)增試劑?1個(gè)/22-25?μl、

5、buffer?a?47.1-53.5%?v/v、

6、前引物各0.032-0.036μm、

7、后引物各0.032-0.036μm、

8、混合凍干保護(hù)劑?22-25%?v/v；

9、所述crispr/cas12a檢測(cè)體系凍干試劑是由crispr/cas12a檢測(cè)體系制成的凍干試劑，所述crispr/cas12a檢測(cè)體系包括如下組分：

10、cas12a?0.20-0.29μm、

11、grna各0.20-0.29μm、

12、ssdna報(bào)告分子2.0-2.9μm、

13、buffer?2.1?8-11.4%?v/v、

14、混合凍干保護(hù)劑?20-29%?v/v；

15、其中，所述混合凍干保護(hù)劑包括如下組分：

16、山梨醇8-20?%?w/v、

17、二甲亞砜?0-15?%?w/v、

18、牛血清白蛋白?0-15?%w/v、

19、海藻糖?40-56?%w/v；

20、所述rpa恒溫?cái)U(kuò)增試劑和buffer?a是安普未來(lái)生物科技有限公司的dna恒溫快速擴(kuò)增試劑盒中的試劑；所述buffer2.1是new?england?biolabs公司的engen?lba?cas12a試劑盒中的試劑。

21、優(yōu)選的，所述rpa凍干試劑是由rpa擴(kuò)增體系制成的凍干試劑，所述rpa擴(kuò)增體系包括如下組分：

22、rpa恒溫?cái)U(kuò)增試劑?1個(gè)/22?μl、

23、buffer?a?53.5%?v/v、

24、前引物各0.036μm、

25、后引物各0.036μm、

26、混合凍干保護(hù)劑?25%?v/v；

27、所述crispr/cas12a檢測(cè)體系凍干試劑是由crispr/cas12a檢測(cè)體系制成的凍干試劑，所述crispr/cas12a檢測(cè)體系包括如下組分：

28、cas12a?0.25μm、

29、grna各0.25μm、

30、ssdna報(bào)告分子2.5μm、

31、buffer?2.1?10%?v/v、

32、混合凍干保護(hù)劑?25%?v/v；

33、其中，所述混合凍干保護(hù)劑包括如下組分：

34、山梨醇20?%?w/v、

35、二甲亞砜?0-15?%?w/v、

36、牛血清白蛋白0-15?%w/v

37、海藻糖?40-56?%w/v。

38、優(yōu)選的，它包括rpa凍干試劑和/或crispr/cas12a檢測(cè)體系凍干試劑；

39、所述rpa凍干試劑是由rpa擴(kuò)增體系制成的凍干試劑，所述rpa擴(kuò)增體系包括如下組分：

40、rpa恒溫?cái)U(kuò)增試劑?1個(gè)/22-25?μl、

41、buffer?a?47.1-53.5%?v/v、

42、前引物各0.032-0.036μm、

43、后引物各0.032-0.036μm、

44、混合凍干保護(hù)劑?22-25%?v/v；

45、所述crispr/cas12a檢測(cè)體系凍干試劑是由crispr/cas12a檢測(cè)體系制成的凍干試劑，所述crispr/cas12a檢測(cè)體系包括如下組分：

46、cas12a?0.20-0.29μm、

47、grna各0.20-0.29μm、

48、ssdna報(bào)告分子2.0-2.9μm、

49、buffer?2.1?8-11.4%?v/v、

50、混合凍干保護(hù)劑?20-29%?v/v；

51、其中，所述混合凍干保護(hù)劑包括如下組分：

52、peg?20-40?%?w/v、

53、牛血清白蛋白15-30?%?w/v、

54、海藻糖20-40?%w/v、

55、甘露醇16-32?%w/v；

56、所述rpa恒溫?cái)U(kuò)增試劑和buffer?a是安普未來(lái)生物科技有限公司的dna恒溫快速擴(kuò)增試劑盒中的試劑；所述buffer2.1是new?england?biolabs公司的engen?lba?cas12a試劑盒中的試劑。

57、優(yōu)選的，所述rpa凍干試劑是由rpa擴(kuò)增體系制成的凍干試劑，所述rpa擴(kuò)增體系包括如下組分：

58、rpa恒溫?cái)U(kuò)增試劑?1個(gè)/22?μl、

59、buffer?a?53.5%?v/v、

60、前引物各0.036μm、

61、后引物各0.036μm、

62、混合凍干保護(hù)劑?25%?v/v；

63、所述crispr/cas12a檢測(cè)體系凍干試劑是由crispr/cas12a檢測(cè)體系制成的凍干試劑，所述crispr/cas12a檢測(cè)體系包括如下組分：

64、cas12a?0.25μm、

65、grna各0.25μm、

66、ssdna報(bào)告分子2.5μm、

67、buffer?2.1?10%?v/v、

68、混合凍干保護(hù)劑?25%?v/v；

69、其中，所述混合凍干保護(hù)劑包括如下組分：

70、peg?40?%?w/v、

71、牛血清白蛋白30?%?w/v、

72、海藻糖40?%w/v、

73、甘露醇32?%w/v。

74、優(yōu)選的，所述前引物包括核苷酸序列如seq?id?no.?1-?seq?id?no.?14所示的引物中的至少一種；

75、所述后引物包括核苷酸序列如seq?id?no.?15-?seq?id?no.?28所示的引物中的至少一種；

76、所述grna包括核苷酸序列如seq?id?no.?29-?seq?id?no.?42所示的rna中的至少一種。

77、優(yōu)選的，所述ssdna報(bào)告分子為修飾有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的單鏈dna報(bào)告分子。

78、本發(fā)明還提供上述用于hpv一鍋法檢測(cè)的凍干試劑在制備hpv病毒檢測(cè)試劑盒中的用途。

79、本發(fā)明還提供一種高危型hpv一鍋法檢測(cè)試劑盒，包括：buffer?b和上述用于hpv一鍋法檢測(cè)的凍干試劑；所述buffer?b是安普未來(lái)生物科技有限公司的dna恒溫快速擴(kuò)增試劑盒中的試劑。

80、本發(fā)明還提供一種應(yīng)用上述高危型hpv一鍋法檢測(cè)試劑盒進(jìn)行非診斷目的的hpv檢測(cè)的方法，包括如下步驟：

81、步驟1，分別復(fù)溶rpa凍干試劑和復(fù)溶crispr/cas12a檢測(cè)體系凍干試劑；

82、步驟2，向復(fù)溶rpa凍干試劑的溶液中加入所述buffer?b和檢測(cè)樣品，孵育反應(yīng)；

83、步驟3，向反應(yīng)體系中加入復(fù)溶crispr/cas12a檢測(cè)體系凍干試劑的溶液，孵育反應(yīng)；

84、步驟4，通過(guò)熒光檢測(cè)或試紙條顯色進(jìn)行檢測(cè)。

85、優(yōu)選的，步驟1中，將復(fù)溶rpa凍干試劑的溶液加入反應(yīng)管，將復(fù)溶crispr/cas12a檢測(cè)體系凍干試劑的溶液加入所述反應(yīng)管的反應(yīng)管蓋中；步驟3中，通過(guò)瞬時(shí)離心操作將復(fù)溶crispr/cas12a檢測(cè)體系凍干試劑的溶液加入所述反應(yīng)管。

86、本發(fā)明針對(duì)14種高危型hpv病毒的一鍋法rpa/crispr檢測(cè)，優(yōu)選了引物和grna，并且，針對(duì)這些特定的引物和grna組合，優(yōu)選了最恰當(dāng)?shù)膬龈杀Ｗo(hù)劑組合。由此，本發(fā)明首次提供了能夠在一個(gè)反應(yīng)容器中（一鍋法）進(jìn)行兩步反應(yīng)的凍干試劑及其制成的試劑盒。該凍干試劑及試劑盒具有如下有益的技術(shù)效果：

87、1、通過(guò)優(yōu)化引物和grna序列，優(yōu)化凍干保護(hù)劑組合，本發(fā)明對(duì)hpv病毒檢測(cè)具有很好的靈敏度、特異性和重復(fù)性，能夠滿足實(shí)際應(yīng)用需求。

88、2、本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)了將hpv病毒的一鍋法rpa/crispr檢測(cè)試劑制成凍干試劑，具有保存和運(yùn)輸方便、試劑性能穩(wěn)定、便于使用等優(yōu)勢(shì)。

89、3、本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了一鍋兩步法的檢測(cè)，能夠在一個(gè)反應(yīng)容器中實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，不存在轉(zhuǎn)移反應(yīng)液的操作，能夠有效避免核酸氣溶膠的污染問(wèn)題。

90、顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

91、以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。