本發(fā)明屬于多肽合成，具體涉及一種蜂毒肽的生產(chǎn)工藝。

背景技術(shù)：

1、蜂毒成分復(fù)雜，作為一種自然狀態(tài)下蜜蜂體內(nèi)的提取的混合物，難以直接研究以及應(yīng)用于臨床的特性。蜂毒肽是從蜂毒中分離純化得來的，為蜂毒中的主要活性成分。蜂毒肽對(duì)于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)具有非常高效的破壞性，包括質(zhì)膜以及胞內(nèi)一些細(xì)胞器的膜結(jié)構(gòu)。其作用機(jī)制主要有通過其兩親性的結(jié)構(gòu)嵌入至磷脂膜結(jié)構(gòu)中，然后在膜上打孔，致使膜結(jié)構(gòu)發(fā)生破裂，膜內(nèi)外環(huán)境的變化最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡；也可以通過影響細(xì)胞內(nèi)介導(dǎo)腫瘤增殖的多條信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。同時(shí)，蜂毒肽還具有抗炎、抑菌、抗癌、抗輻射、抑制血小板凝集等作用，可有效地治療肩周炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用。正因?yàn)榉涠倦木哂猩锘钚愿?、不污染環(huán)境等特點(diǎn)，可以研制開發(fā)出機(jī)體免疫調(diào)節(jié)劑等產(chǎn)品，具有很大的市場開發(fā)前景，因而引起了廣泛關(guān)注。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種采用固相合成、液相合成肽段、至少1個(gè)肽段、收率高、純度高的蜂毒肽的制備方法。

2、本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采取的技術(shù)方案為：

3、一種蜂毒肽的制備方法，包括：按蜂毒肽序列的順序采用固相合成法合成得到蜂毒肽-肽樹脂，切割以及純化得到蜂毒肽；固相合成法中采用逐個(gè)偶聯(lián)氨基酸試劑或采用至少1個(gè)以上的蜂毒肽肽段以及單個(gè)氨基酸試劑進(jìn)行的偶聯(lián)，蜂毒肽肽段的氨基酸數(shù)目為4-8個(gè)。本發(fā)明通過采用至少1個(gè)以上的特定的氨基酸數(shù)目的蜂毒肽肽段進(jìn)行蜂毒肽的合成時(shí)，可以大大提高蜂毒肽的收率，蜂毒肽肽段中氨基酸數(shù)目不能太多，太多同樣會(huì)影響蜂毒肽的收率，經(jīng)過研究，本發(fā)明公開了采用不同蜂毒肽肽段進(jìn)行蜂毒肽的合成，以提高蜂毒肽的收率的效果。

4、優(yōu)選地，蜂毒肽肽段如下所示至少1種：

5、肽段1的序列為fmoc-leu-pro-ala-leu-ile-?ser(tbu)-trp(boc)；

6、肽段2的序列為fmoc-leu-lys(boc)-val-leu-thr(tbu)-thr(tbu)-gly；

7、肽段3的序列為fmoc-gly-ile-gly-ala-val；

8、肽段4的序列為fmoc-ala-leu-ile-ser(tbu)-trp(boc)-ile；

9、肽段5的序列為fmoc-val-leu-thr(tbu)-thr(tbu)-gly-leu-pro；

10、肽段6的序列為fmoc-gly-ile-gly-ala-val-leu-lys(boc)。

11、優(yōu)選地，蜂毒肽肽段的數(shù)目為3個(gè)，蜂毒肽-肽樹脂的合成中采用肽段1-3；或，蜂毒肽肽段的數(shù)目為3個(gè)，蜂毒肽-肽樹脂的合成中采用肽段4-6。本發(fā)明中采用肽段1-3及單個(gè)氨基酸試劑用于蜂毒肽的合成中，可以提高蜂毒肽的收率，提高蜂毒肽的制備效果；還可以采用肽段4-6及單個(gè)氨基酸試劑用于蜂毒肽的合成中，得到的蜂毒肽的收率高。

12、優(yōu)選地，蜂毒肽肽段的合成采用液相合成載體合成，液相合成載體由2，4-二羥基苯甲醛、1,4-二溴環(huán)己烷和溴代丙二酸二乙酯合成以及還原后得到。

13、更優(yōu)選地，1,4-二溴環(huán)己烷的使用摩爾量為2，4-二羥基苯甲醛的使用摩爾量的30-50%；或，溴代丙二酸二乙酯的使用摩爾量為2，4-二羥基苯甲醛的使用摩爾量80-120%。

14、更優(yōu)選地，液相合成載體的合成中，先由2，4-二羥基苯甲醛和1,4-二溴環(huán)己烷進(jìn)行反應(yīng)，然后再加入溴代丙二酸二乙酯進(jìn)行反應(yīng)，最后由硼氫化鈉還原得到液相合成載體。

15、更優(yōu)選地，2，4-二羥基苯甲醛和1,4-二溴環(huán)己烷在含有碳酸鉀的dmf溶液中進(jìn)行反應(yīng)，還原在四氫呋喃溶液中采用硼氫化鈉還原。

16、優(yōu)選地，固相合成中，采用脫保護(hù)液除去保護(hù)基團(tuán)，脫保護(hù)液為含有15-25%pip的dmf溶液。

17、優(yōu)選地，切割采用切割液處理，切割液由tfa、tis、edt、phoh和水組成，切割液中tfa、tis、edt、phoh和水以體積比1：0.02-0.1：0.01-0.05：0.01-0.05：0.01-0.05的比例混合。

18、本發(fā)明公開了蜂毒肽肽段在制備蜂毒肽中的用途，蜂毒肽肽段如下所示至少1種：

19、肽段1的序列為fmoc-leu-pro-ala-leu-ile-?ser(tbu)-trp(boc)；

20、肽段2的序列為fmoc-leu-lys(boc)-val-leu-thr(tbu)-thr(tbu)-gly；

21、肽段3的序列為fmoc-gly-ile-gly-ala-val；

22、肽段4的序列為fmoc-ala-leu-ile-ser(tbu)-trp(boc)-ile；

23、肽段5的序列為fmoc-val-leu-thr(tbu)-thr(tbu)-gly-leu-pro；

24、肽段6的序列為fmoc-gly-ile-gly-ala-val-leu-lys(boc)。

25、優(yōu)選地，液相合成載體的制備中，將碳酸鉀加入dmf中，然后加入2，4-二羥基苯甲醛和1,4-二溴環(huán)己烷，在惰性氣體氛圍下，在60-80℃的溫度下反應(yīng)3-12h，然后再加入溴代丙二酸二乙酯，在60-80℃的溫度下反應(yīng)3-12h，反應(yīng)完成后分離中間產(chǎn)物，將中間產(chǎn)物加入四氫呋喃溶液中，然后加入硼氫化鈉在30-50℃的溫度下反應(yīng)2-5h，反應(yīng)完成后加純水淬滅反應(yīng)，分離得到液相合成載體。本發(fā)明還公開了一種可以用于液體合成肽段的液相合成載體，在上述液相合成載體制備中，將1,4-二溴環(huán)己烷替換為溴環(huán)己烷，得到的產(chǎn)物將無法作為液相合成載體應(yīng)用于肽段的制備中。

26、更優(yōu)選地，液相合成載體的制備中，碳酸鉀的使用量為dmf的10-20wt%。

27、更優(yōu)選地，液相合成載體的制備中，2，4-二羥基苯甲醛的使用量為dmf10-20wt%。

28、更優(yōu)選地，液相合成載體的制備中，1,4-二溴環(huán)己烷的使用摩爾量為2，4-二羥基苯甲醛的使用摩爾量的30-50%。

29、更優(yōu)選地，液相合成載體的制備中，溴代丙二酸二乙酯的使用摩爾量為2，4-二羥基苯甲醛的使用摩爾量80-120%。

30、更優(yōu)選地，液相合成載體的制備中，中間產(chǎn)物的分離中，冷卻反應(yīng)液至0-10℃，加入0.1-1m鹽酸和水，鹽酸和水的體積比為1：0.1-1，析出沉淀后過濾，洗滌，干燥，得到中間體。

31、更優(yōu)選地，液相合成載體的制備中，四氫呋喃溶液由四氫呋喃與甲醇混合而成，四氫呋喃溶液中四氫呋喃與甲醇以體積比為1：0.01-0.2的比例混合，中間體的使用量為四氫呋喃溶液的10-30wt%。

32、更優(yōu)選地，液相合成載體的制備中，硼氫化鈉的使用量為中間體的10-30wt%。

33、優(yōu)選地，肽段的制備中，將液相合成載體加入dcm中，然后加入氨基酸試劑、dic和dmap進(jìn)行偶聯(lián)處理，偶聯(lián)完成后進(jìn)行脫保護(hù)處理，按肽段的順序替換氨基酸試劑依次進(jìn)行偶聯(lián)處理、脫保護(hù)處理，偶聯(lián)最后一個(gè)氨基酸后不進(jìn)行脫保護(hù)處理，采用切割液進(jìn)行切割處理除去液相合成載體，得到肽段。

34、更優(yōu)選地，肽段的制備中，液相合成載體的使用量為dcm的10-30wt%。

35、更優(yōu)選地，肽段的制備中，氨基酸試劑的使用量為液相合成載體的40-80wt%。

36、更優(yōu)選地，肽段的制備中，dic的使用量為液相合成載體的0.1-1wt%。

37、更優(yōu)選地，肽段的制備中，dmap的使用量為液相合成載體的1-4wt%。

38、更優(yōu)選地，肽段的制備中，肽段包括上述肽段1-6。

39、更優(yōu)選地，肽段制備的偶聯(lián)處理中，在20-40℃下攪拌反應(yīng)2-8h，加入乙腈析出結(jié)晶，過濾得到中間體-液相合成載體。

40、更優(yōu)選地，肽段制備的脫保護(hù)處理中，將中間體-液相合成載體加入脫保護(hù)液中，20-40℃下處理3-10min，調(diào)節(jié)ph至中性，析出產(chǎn)物，脫保護(hù)液為含有5-20vol%哌啶和0.5-2vol%dbu的thf溶液，脫保護(hù)液的使用量為浸沒中間體-液相合成載體。

41、更優(yōu)選地，肽段制備的切割處理中，將切割液加入肽段1-液相合成載體中，20-40℃下攪拌處理20-60min，抽濾，異丙醚重結(jié)晶，切割液為含有5-20vol%tfe和0.5-2%tfa的dcm溶液，切割液的使用量為浸沒肽段1-液相合成載體。

42、優(yōu)選地，蜂毒肽的制備中，采用am樹脂合成蜂毒肽，首先將fmoc-linker-oh偶聯(lián)至am樹脂上，然后按蜂毒肽序列的順序偶聯(lián)氨基酸試劑，偶聯(lián)完成后分離處理得到蜂毒肽-肽樹脂，蜂毒肽-肽樹脂經(jīng)切割處理得到蜂毒肽粗品，蜂毒肽粗品經(jīng)純化處理得到蜂毒肽。

43、蜂毒肽的序列為：h-gly-ile-gly-ala-val-leu-lys-val-leu-thr-thr-gly-leu-pro-ala-leu-ile-ser-trp-ile-lys-arg-lys-arg-gln-gln-nh2。

44、優(yōu)選地，活化linker試劑的制備中，將fmoc-linker-oh和hobt加入dmf中，攪拌溶解后在2-8℃的溫度下加入dic，在2-8℃的溫度下處理10-20min，得到活化linker試劑。

45、更優(yōu)選地，活化linker試劑的制備中，fmoc-linker-oh的使用量與dmf的使用量關(guān)系為0.3-1.5mol/l，hobt的使用摩爾量為fmoc-linker-oh的使用摩爾量的60-120%，dic的使用摩爾量為fmoc-linker-oh的使用摩爾量的60-120wt%。

46、優(yōu)選地，fmoc-linker-am樹脂的制備中，將am樹脂加入脫保護(hù)液中，在30-35℃下處理20-50min，dmf洗滌，然后加入活化linker試劑，在30-35℃下反應(yīng)2-4h，然后加入diea反應(yīng)20-50min，反應(yīng)完成后抽濾得到fmoc-linker-am樹脂。

47、優(yōu)選地，活化氨基酸試劑的制備中，將氨基酸試劑和hobt加入dmf中，攪拌溶解后在2-8℃的溫度下加入dic，在2-8℃的溫度下處理10-20min，得到活化氨基酸試劑。氨基酸試劑的使用量與dmf的使用量關(guān)系為0.3-1.5mol/l，hobt的使用摩爾量為氨基酸試劑的使用摩爾量的80-120%，dic的使用摩爾量為氨基酸試劑的使用摩爾量的80-120%。氨基酸試劑包括：fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-val-oh。

48、固相合成的順序fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-val-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-gly-oh。

49、優(yōu)選地，蜂毒肽-肽樹脂的制備中，對(duì)fmoc-linker-am樹脂進(jìn)行脫保護(hù)處理，然后加入活化氨基酸試劑，在30-35℃下反應(yīng)2-4h，反應(yīng)完成后進(jìn)行脫保護(hù)處理，按蜂毒肽序列的順序重復(fù)前述偶聯(lián)氨基酸試劑的步驟，首個(gè)氨基酸試劑為fmoc-gln(trt)-oh，然后依次偶聯(lián)的氨基酸試劑如下所示：fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-val-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-gly-oh。

50、更優(yōu)選地，蜂毒肽-肽樹脂的制備中，在偶聯(lián)氨基酸試劑時(shí)，需要對(duì)前一偶聯(lián)完成的產(chǎn)物進(jìn)行脫保護(hù)處理，脫保護(hù)處理包括偶聯(lián)后洗滌、脫保護(hù)以及脫保護(hù)后洗滌。

51、更優(yōu)選地，蜂毒肽-肽樹脂的制備中，偶聯(lián)后洗滌中，采用dmf洗滌偶聯(lián)后的產(chǎn)物1-3次，洗滌完成后抽濾。

52、更優(yōu)選地，蜂毒肽-肽樹脂的制備中，脫保護(hù)中，將脫保護(hù)液加入偶聯(lián)后洗滌的產(chǎn)物中，在30-35℃的溫度下處理20-40min，處理完后抽濾。脫保護(hù)液為含有15-25%pip的dmf溶液。

53、更優(yōu)選地，蜂毒肽-肽樹脂的制備中，脫保護(hù)后洗滌中，采用dmf洗滌脫保護(hù)后的產(chǎn)物2-6次，洗滌完成后抽濾。

54、優(yōu)選地，蜂毒肽粗品由蜂毒肽-肽樹脂經(jīng)切割處理得到，切割處理中將蜂毒肽-肽樹脂加入切割液中，在25-35℃下切割處理2-6h，過濾分離樹脂，濾液中加入甲叔醚，析出沉淀，過濾，得到蜂毒肽粗品。

55、更優(yōu)選地，切割液由tfa、tis、edt、phoh和水組成，切割液中tfa、tis、edt、phoh和水以體積比1：0.02-0.1：0.01-0.05：0.01-0.05：0.01-0.05的比例混合。切割液浸沒蜂毒肽-肽樹脂，甲叔醚適量使用以析出蜂毒肽粗品。

56、優(yōu)選地，蜂毒肽由蜂毒肽粗品純化處理后得到，純化處理為hplc處理。

57、本發(fā)明由于采用了液相合成載體合成蜂毒肽肽段，然后將蜂毒肽肽段應(yīng)用于蜂毒肽的固相合成中，然后輔以蜂毒肽的單個(gè)氨基酸試劑的偶聯(lián)，本發(fā)明合成蜂毒肽的方法中，需要設(shè)計(jì)使用特定序列的蜂毒肽肽段，以及至少1個(gè)的蜂毒肽的肽段的使用，因而具有如下有益效果：本發(fā)明制備得到的蜂毒肽的收率高，純化后的蜂毒肽的純度高。因此，本發(fā)明是一種采用固相合成、液相合成肽段、至少1個(gè)肽段、收率高、純度高的蜂毒肽的制備方法。