本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物，涉及基于rnai技術(shù)防治農(nóng)業(yè)害螨，具體為一種防治山楂葉螨和二斑葉螨的靶基因 srp54k及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、山楂葉螨和二斑葉螨，屬于葉螨科葉螨屬，是一種世界性害螨，主要危害果樹、設(shè)施蔬菜等農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物。兩種害螨，體型小，繁殖能力強(qiáng)，擴(kuò)散速度快。長期使用化學(xué)農(nóng)藥防控，導(dǎo)致其產(chǎn)生較強(qiáng)的抗性。

2、rna?干擾（rna?interference，rnai）又稱?rna?沉默（rna?silencing），是真核生物中一種由雙鏈?rna（double-stranded?rna，dsrna）或者?sirna（小干擾?rna）、mirna（微小?rna）誘發(fā)，使同源?mrna?高效特異性的降解或表達(dá)受到抑制，從而阻止靶基因蛋白翻譯的生物學(xué)現(xiàn)象。利用?rnai，可干擾靶標(biāo)害蟲的正常生長，減輕對寄主植物的為害，最終達(dá)到防治有害生物與保護(hù)植物的目的。

3、rnai?技術(shù)在農(nóng)業(yè)害蟲治理中具有極大潛力。rnai技術(shù)用于防治葉螨具有巨大潛力，但是目前國內(nèi)外鮮有對山楂葉螨和二斑葉螨基因功能的研究及其殺蟲活性靶標(biāo)基因的報道。

4、經(jīng)前期試驗表明利用合適的外源dsrna溶液通過浸泡卵的方式即可實現(xiàn)對山楂葉螨和二斑葉螨的毒性，因此從基因?qū)用骈_發(fā)適用于防治山楂葉螨和二斑葉螨的外源dsrna產(chǎn)品，使用方便、成本低，更由于基因的特異性，可實現(xiàn)精確、優(yōu)異的防治效果，對環(huán)境友好，在山楂葉螨和二斑葉螨的防治方面具有很大的應(yīng)用前景。然而，相關(guān)靶標(biāo)基因的篩選，以及防治效果好、特異、穩(wěn)定的dsrna設(shè)計是最大的難題和關(guān)鍵問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明克服現(xiàn)有山楂葉螨和二斑葉螨防治技術(shù)的缺陷和不足，提供一種防治山楂葉螨和二斑葉螨的 srp54k靶基因及其應(yīng)用、由其合成的dsrna及dsrna的應(yīng)用。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

3、一種防治山楂葉螨和二斑葉螨的 srp54k靶基因，干擾該靶標(biāo)基因后，導(dǎo)致其生長發(fā)育異常而死亡，并且導(dǎo)致成螨產(chǎn)卵量顯著降低，所述 srp54k靶基因的核苷酸序列如seqid?no.1?和seq?id?no：2所示。

4、一種防治山楂葉螨和二斑葉螨的 srp54k靶基因，干擾該靶標(biāo)基因后，導(dǎo)致其生長發(fā)育異常而死亡，并且導(dǎo)致成螨產(chǎn)卵量顯著降低，以 srp54k靶基因為模板合成dsrna，所述dsrna的核苷酸序列如seq?id?no：3和seq?id?no：4所示。

5、所述dsrna的制備包括以下步驟：

6、s1、以兩種葉螨的cdna序列為模板，合成 srp54k基因片段；

7、s2、以 srp54k基因片段作為模板，設(shè)計含有t7啟動子序列的引物序列對；

8、s3、通過pcr擴(kuò)增得到dsrna合成模板；

9、s4、體外合成dsrna。

10、所述s1具體為：根據(jù) srp54k基因的dna序列設(shè)計引物對，以兩種葉螨的cdna序列為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到 srp54k基因片段。

11、一種所述的 srp54k靶基因或所述的dsrna的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括下列任一項：

12、1）所述的 srp54k靶基因或所述的dsrna在防治山楂葉螨和二斑葉螨中的應(yīng)用；

13、2）所述的 srp54k靶基因或所述的dsrna在預(yù)防山楂葉螨和二斑葉螨蟲害和/或制備防治山楂葉螨和二斑葉螨的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

14、3）所述的 srp54k靶基因或所述的dsrna在促進(jìn)山楂葉螨和二斑葉螨死亡和/或制備促進(jìn)山楂葉螨和二斑葉螨死亡的產(chǎn)品中的應(yīng)用。實驗結(jié)果顯示：dssrp54k溶液浸泡處理后，能在山楂葉螨和二斑葉螨體內(nèi)引起強(qiáng)烈的rnai效應(yīng)，導(dǎo)致體內(nèi) srp54k基因的表達(dá)量明顯降低，進(jìn)而導(dǎo)致山楂葉螨和二斑葉螨死亡或抑制生殖，從而達(dá)到防治山楂葉螨和二斑葉螨的目的。

15、本發(fā)明主要解決了傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥在防治山楂葉螨和二斑葉螨過程中存在的環(huán)境污染、害蟲抗藥性增強(qiáng)以及非目標(biāo)生物受影響等問題。通過利用基因沉默技術(shù)，特別是針對害蟲體內(nèi)的 srp54k基因進(jìn)行dsrna的設(shè)計與合成，本發(fā)明提供了一種更為環(huán)保、高效且特異的害蟲控制方法，重點(diǎn)考察了dsrna（雙鏈rna）在二斑葉螨防治的效果，通過dsrna靶向沉默該基因后害蟲的表型反應(yīng)和生存生殖能力變化，主要的難點(diǎn)在于dsrna片段對二斑葉螨體內(nèi) srp54k基因的靶向沉默作用的高效特異性。

16、本發(fā)明公開的防治山楂葉螨和二斑葉螨的 srp54k靶基因及其應(yīng)用相對于現(xiàn)有技術(shù)所產(chǎn)生的有益效果為：

17、本發(fā)明利用 srp54k基因防治山楂葉螨和二斑葉螨，通過 srp54k基因合成用于防治山楂葉螨和二斑葉螨的dsrna，該dsrna可靶向沉默上述 srp54k基因。利用dsrna溶液浸泡卵，使得 dssrp54k進(jìn)入山楂葉螨和二斑葉螨體內(nèi)，該dsrna可沉默/抑制山楂葉螨和二斑葉螨的 srp54k基因表達(dá)，促進(jìn)山楂葉螨和二斑葉螨死亡，從而達(dá)到防治山楂葉螨和二斑葉螨的目的。

18、本發(fā)明篩選得到一種山楂葉螨和二斑葉螨的致死基因（ srp54k），并開發(fā)了其高效沉默的dsrna，能夠?qū)崿F(xiàn)對山楂葉螨和二斑葉螨的高效防治，利用dsrna對山楂葉螨和二斑葉螨的致死效應(yīng)達(dá)到防治目的。該方法操作方便、有效性和靈敏性好、殺蟲效率高，且具有環(huán)境友好等諸多優(yōu)點(diǎn)，有很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種防治山楂葉螨和二斑葉螨的srp54k靶基因，所述srp54k靶基因的核苷酸序列如seq?id?no.1?和seq?id?no：2所示。

2.一種防治山楂葉螨和二斑葉螨的dsrna，采用所述的srp54k靶基因合成dsrna，所述dsrna的核苷酸序列如seq?id?no：3和seq?id?no：4所示；所述dsrna的制備包括以下步驟：

3.權(quán)利要求1或2所述的srp54k靶基因或dsrna的應(yīng)用，包括下列任一項：

4.一種防治山楂葉螨和二斑葉螨的方法，其特征在于，所述方法是將權(quán)利要求2所述的dsrna導(dǎo)入山楂葉螨和二斑葉螨體內(nèi)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種防治山楂葉螨和二斑葉螨的Srp54k靶基因及其應(yīng)用、由其合成的dsRNA及dsRNA的應(yīng)用；Srp54k靶基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示，dsRNA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示；干擾SRP54K后導(dǎo)致山楂葉螨和二斑葉螨的卵，顯著影響存活率達(dá)到防治目的；該方法操作方便、有效性和靈敏性好、殺蟲效率高，且具有環(huán)境友好等諸多優(yōu)點(diǎn)，有很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：任美鳳,楊靜,王逸飛,段園鵬,陸俊姣,李大琪
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2