本發(fā)明涉及car-t免疫細(xì)胞，具體涉及共表達(dá)細(xì)胞因子il15和淋巴結(jié)歸巢信號ccr7的car-t細(xì)胞的構(gòu)建方法，優(yōu)化的car-t細(xì)胞的提升了增殖、活化、抗凋亡和抗耗竭性，維持低分化表型等優(yōu)良特性，并在突破免疫屏障抑制、增加腫瘤浸潤和改善t細(xì)胞活性等方面展現(xiàn)出顯著效果的car-t優(yōu)化策略和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、car-t療法具有特異性強(qiáng)，選擇性高的特點(diǎn)，已成為時(shí)下血液性惡性腫瘤最流行的治療方法，且展示出顯著的應(yīng)答率和突破性的治療效果，甚至一部分復(fù)發(fā)難治性大b細(xì)胞淋巴瘤(lbcl)和b細(xì)胞急性淋巴性白血病(b-all)患者在cd19?car-t治療后獲得持久的完全緩解。然而，高昂的治療價(jià)格、安全性及治療后的復(fù)發(fā)限制了car-t療法的進(jìn)一步臨床應(yīng)用。研究表明，car-t細(xì)胞耗竭是患者在細(xì)胞治療后疾病復(fù)發(fā)的主要原因，主要表現(xiàn)為car-t細(xì)胞在體內(nèi)存活、擴(kuò)增、歸巢及腫瘤浸潤效果不佳，通常car-t細(xì)胞在回輸三周后便會消退。因而，延長car-t細(xì)胞在體內(nèi)存活時(shí)間，提高car-t細(xì)胞體內(nèi)擴(kuò)增和歸巢能力對于car-t治療惡性腫瘤的臨床應(yīng)用至關(guān)重要。

2、car與免疫調(diào)節(jié)因子的適當(dāng)結(jié)合可以增強(qiáng)car-t細(xì)胞的抗腫瘤能力，同時(shí)協(xié)同腫瘤反應(yīng)性受體t細(xì)胞的激活及其記憶的形成。細(xì)胞因子il15在重塑t細(xì)胞記憶樣免疫表型，延長存活時(shí)間，降低t細(xì)胞耗竭標(biāo)志物表達(dá)從而增加抗凋亡特性，及促進(jìn)干細(xì)胞記憶樣cd8+t細(xì)胞（tscm）表型的保存方面具有顯著效果。除了t細(xì)胞受損和分化狀態(tài)影響car-t細(xì)胞治療療效外，te細(xì)胞“歸巢缺陷”是導(dǎo)致無效免疫治療另一主要因素。淋巴結(jié)歸巢和再循環(huán)標(biāo)記ccr7可促進(jìn)t細(xì)胞淋巴歸巢免疫表型，t細(xì)胞歸巢和外滲可改善car-t細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的持久性，t細(xì)胞歸巢伴隨的淋巴細(xì)胞再循環(huán)，使得體內(nèi)淋巴細(xì)胞在外周免疫器官和組織的分布更趨合理，有望突破免疫屏障的抑制。

3、因此，輔以改善體內(nèi)car-t細(xì)胞擴(kuò)增/持續(xù)性/歸巢/趨化等免疫表型的元件，將有望提高car-t細(xì)胞療法在患者惡性腫瘤治療的應(yīng)答率和緩解持久性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對上述問題，本發(fā)明提供一種共表達(dá)細(xì)胞因子il15和淋巴結(jié)歸巢信號ccr7的car-t細(xì)胞的構(gòu)建方法，同時(shí)共表達(dá)car、細(xì)胞因子il15和淋巴結(jié)歸巢信號ccr7，從而改善car-t細(xì)胞的增殖、存活、耗竭等免疫表型，提高car-t細(xì)胞在腫瘤治療中的療效。

2、共表達(dá)細(xì)胞因子il15和淋巴結(jié)歸巢信號ccr7的car-t細(xì)胞的構(gòu)建方法，將il15和ccr7基因替換pcdh-cmv-car-ef1-cogfp-t2a-puro質(zhì)粒中的cogfp和puro基因得到目的質(zhì)粒pcdh-cmv-car-ef1-il15-t2a-ccr7，病毒包裝后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，il15的核苷酸序列如seq?idno.2所示，ccr7的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

3、進(jìn)一步的，將15x7-cd19-car-jurkat細(xì)胞與數(shù)量梯度的靶細(xì)胞raji共孵育后，檢測car-jurkat細(xì)胞中cd69蛋白激活的表達(dá)情況；15x7-cd19-car-t細(xì)胞與靶細(xì)胞raji共孵育后，通過ldh檢測靶細(xì)胞殺傷效果。

4、進(jìn)一步的，將cd19-car-t和15x7-cd19-car-t細(xì)胞在基礎(chǔ)培養(yǎng)基單純加自體血漿、氨芐/鏈霉素雙抗生素，不添加細(xì)胞因子如il2、il15、il7培養(yǎng)的條件下，體外1，2，4，6，10天，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定car-t細(xì)胞的增殖情況；cd19-car-t和15x7-cd19-car-t細(xì)胞與靶細(xì)胞raji按照不同的效靶比共孵育后，elisa法檢測car-t細(xì)胞中細(xì)胞因子il-2、inf-γ分泌情況。

5、進(jìn)一步的，基礎(chǔ)培養(yǎng)基單純加自體血漿、氨芐/鏈霉素雙抗生素，不添加細(xì)胞因子如il2、il15、il7培養(yǎng)，培養(yǎng)至第6天提取rna，qpcr法檢測cd19-car-t和15x7-cd19-car-t細(xì)胞表面干細(xì)胞樣/記憶樣標(biāo)志物il-7r表達(dá)和t細(xì)胞表面抑制性受體pd-1，tim-3，lag3，ctla4表達(dá)情況，評估car-t細(xì)胞的免疫表型狀態(tài)。

6、本發(fā)明提供的共表達(dá)細(xì)胞因子il15和淋巴結(jié)歸巢信號ccr7的car-t細(xì)胞的構(gòu)建方法，促進(jìn)t細(xì)胞增殖、活化、抗凋亡和耗竭，維持低分化表型等優(yōu)良特性，并在突破免疫屏障抑制、增加腫瘤浸潤和改善t細(xì)胞活性等方面展現(xiàn)出顯著效果的car-t優(yōu)化策略和應(yīng)用。

技術(shù)特征：

1.共表達(dá)細(xì)胞因子il15和淋巴結(jié)歸巢信號ccr7的car-t細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，將il15和ccr7基因替換pcdh-cmv-car-ef1-cogfp-t2a-puro質(zhì)粒中的cogfp和puro基因得到目的質(zhì)粒pcdh-cmv-car-ef1-il15-t2a-ccr7，病毒包裝后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，il15的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，ccr7的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的共表達(dá)細(xì)胞因子il15和淋巴結(jié)歸巢信號ccr7的car-t細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，將15x7-cd19-car-jurkat細(xì)胞與數(shù)量梯度的靶細(xì)胞raji共孵育后，檢測car-jurkat細(xì)胞中cd69蛋白激活的表達(dá)情況；15x7-cd19-car-t細(xì)胞與靶細(xì)胞raji共孵育后，通過ldh檢測靶細(xì)胞殺傷效果。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的共表達(dá)細(xì)胞因子il15和淋巴結(jié)歸巢信號ccr7的car-t細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，將cd19-car-t和15x7-cd19-car-t細(xì)胞在基礎(chǔ)培養(yǎng)基單純加自體血漿、氨芐/鏈霉素雙抗生素，不添加細(xì)胞因子il2、il15、il7培養(yǎng)的條件下，體外1，2，4，6，10天，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定car-t細(xì)胞的增殖情況；cd19-car-t和15x7-cd19-car-t細(xì)胞與靶細(xì)胞raji按照不同的效靶比共孵育后，elisa法檢測car-t細(xì)胞中細(xì)胞因子il-2、inf-γ分泌情況。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的共表達(dá)細(xì)胞因子il15和淋巴結(jié)歸巢信號ccr7的car-t細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于，基礎(chǔ)培養(yǎng)基單純加自體血漿、氨芐/鏈霉素雙抗生素，不添加細(xì)胞因子il2、il15、il7培養(yǎng)，培養(yǎng)至第6天提取rna，qpcr法檢測cd19-car-t和15x7-cd19-car-t細(xì)胞表面干細(xì)胞樣/記憶樣標(biāo)志物il-7r表達(dá)和t細(xì)胞表面抑制性受體pd-1，tim-3，lag3，ctla4表達(dá)情況，評估car-t細(xì)胞的免疫表型狀態(tài)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種共表達(dá)細(xì)胞因子IL15和淋巴結(jié)歸巢信號CCR7的CAR?T細(xì)胞的構(gòu)建方法，本方法能夠與促進(jìn)T細(xì)胞增殖、活化、抗凋亡和耗竭，維持低分化表型等優(yōu)良特性，并在突破免疫屏障抑制、增加腫瘤浸潤和改善T細(xì)胞活性等方面展現(xiàn)出顯著效果的CAR?T優(yōu)化策略和應(yīng)用。

技術(shù)研發(fā)人員：李濤,姚宏,黃彩秀,胡小媛
受保護(hù)的技術(shù)使用者：云南省腫瘤醫(yī)院（昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6