本發(fā)明屬于基因工程、代謝工程，尤其是一種發(fā)酵生產(chǎn)l-組氨酸的大腸桿菌基因工程菌、方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、l-組氨酸是組成蛋白質(zhì)的基本成分，被認(rèn)為是一種人類必需氨基酸，具有良好的生理特性，被廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)中?，F(xiàn)階段組氨酸的生產(chǎn)方法主要包括蛋白水解法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。化學(xué)合成法生產(chǎn)組氨酸，容易產(chǎn)生外消旋混合物，且工藝復(fù)雜，其產(chǎn)品質(zhì)量難以達(dá)到藥用級(jí)原料藥的質(zhì)量要求。蛋白水解法生產(chǎn)組氨酸，主要以豬毛發(fā)或豬血粉為原料，經(jīng)過水洗提取生產(chǎn)組氨酸，但此方法所用原料經(jīng)生產(chǎn)后的組氨酸所含雜質(zhì)成分復(fù)雜，無法滿足藥用級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，且存在引入病毒的風(fēng)險(xiǎn)。相較而言，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)組氨酸具有生產(chǎn)效率高、產(chǎn)品純度高、原料來源廣泛、成本低廉、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，更加適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。

2、現(xiàn)有技術(shù)中cn111154704a通過誘變篩選獲得了一株能夠高產(chǎn)組氨酸的粘質(zhì)沙雷氏菌（serratia?marcescens），該菌株具有如下特征：①組氨酸酶缺陷；②atp-磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶158位的丙氨酸突變?yōu)楸奖彼幔?52位的蘇氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚?71位的谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼?；③具有組氨酸結(jié)構(gòu)類似物以及嘌呤結(jié)構(gòu)類似物抗性。該菌株已于2019年12月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為cgmcc?no.19116。在50?l發(fā)酵罐中經(jīng)過45?h發(fā)酵，該菌株組氨酸產(chǎn)量達(dá)到40?g/l，糖酸轉(zhuǎn)化率可達(dá)16%。但是，粘質(zhì)沙雷氏菌的發(fā)酵液較為粘稠，嚴(yán)重影響了組氨酸的分離提取，不利于工業(yè)化規(guī)模放大生產(chǎn)。

3、為了解決上述問題，本發(fā)明以大腸桿菌escherichia?coli?mg1655作為底盤細(xì)胞，利用分子生物學(xué)技術(shù)，將serratia?marcescens?cgmcc?no.19116菌株的組氨酸操縱子基因整合到底盤細(xì)胞中，并對(duì)其相關(guān)代謝途徑進(jìn)行梳理，獲得一株能夠高產(chǎn)組氨酸的大腸桿菌基因工程菌株。大腸桿菌營養(yǎng)需求較低，發(fā)酵液成分簡單，產(chǎn)品易提取，因此更適合工業(yè)化放大生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種發(fā)酵生產(chǎn)l-組氨酸的大腸桿菌基因工程菌、方法及應(yīng)用。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

3、一種發(fā)酵生產(chǎn)l-組氨酸的大腸桿菌基因工程菌，所述菌株是以野生型大腸桿菌escherichia?coli?mg1655為出發(fā)菌株，在基因組上敲除乳糖操縱子阻遏蛋白編碼基因laci和prpp合成酶的反式調(diào)控基因purr；在基因組上整合內(nèi)源的prpp合成酶編碼基因prs、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶編碼基因zwf和6-磷酸葡萄糖脫氫酶編碼基因gnd，用于強(qiáng)化前體prpp的供應(yīng)；在基因組上整合來自serratia?marcescens?cgmcc?no.19116的七個(gè)組氨酸操縱子基因hisg、hisd、hisb、hisc、hisa、hisf/h、hisie，用于打通組氨酸的合成代謝；在基因組上整合corynebacterium?glutamicum?(谷氨酸棒桿菌)atcc?13032來源的膜蛋白基因cgl2458，用于促進(jìn)組氨酸的外排。

4、進(jìn)一步地，所述乳糖操縱子阻遏蛋白編碼基因laci的基因序列為genbank：945007所示的序列，所述prpp合成酶的反式調(diào)控基因purr的基因序列為genbank：945226所示的序列，所述prpp合成酶編碼基因prs的基因序列為seq?id?no.1所示的序列，所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶編碼基因zwf的基因序列為genbank：946370所示的序列，所述6-磷酸葡萄糖脫氫酶編碼基因gnd的基因序列為genbank：946554所示的序列，所述基因hisg的基因序列為seqid?no.2所示的序列及與其相似度大于80%以上的序列，所述hisd的基因序列為seq?idno.3所示的序列及與其相似度大于80%以上的序列，所述hisb的基因序列為seq?id?no.4所示的序列及與其相似度大于80%以上的序列，所述hisc的基因序列為seq?id?no.5所示的序列及與其相似度大于80%以上的序列，所述hisa的基因序列為seq?id?no.6所示的序列及與其相似度大于80%以上的序列，所述hisf/h的基因序列為seq?id?no.7所示的序列及與其相似度大于80%以上的序列，所述hisie的基因序列為seq?id?no.8所示的序列及與其相似度大于80%以上的序列，所述膜蛋白基因cgl2458的基因序列為seq?id?no.9所示的序列。

5、如上所述的大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，所述方法是采用crispr/cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)逐步改造獲得，步驟如下：

6、（1）敲除乳糖操縱子阻遏蛋白編碼基因laci；

7、（2）敲除prpp合成酶的反式調(diào)控基因purr；

8、（3）在假基因位點(diǎn)yghx整合內(nèi)源的prpp合成酶編碼基因prs，由ptrc啟動(dòng)子控制；

9、（4）在假基因位點(diǎn)yeep整合內(nèi)源的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶編碼基因zwf，由ptrc啟動(dòng)子控制；

10、（5）在假基因位點(diǎn)rph整合內(nèi)源的6-磷酸葡萄糖脫氫酶編碼基因gnd，由ptrc啟動(dòng)子控制；

11、（6）在假基因位點(diǎn)yciq整合外源的atp轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶編碼基因hisg，由ptrc啟動(dòng)子控制；

12、（7）在假基因位點(diǎn)mbha整合外源的組氨醛脫氫酶編碼基因hisd，由ptrc啟動(dòng)子控制；

13、（8）在假基因位點(diǎn)yjiv整合外源的組氨醇磷酸酶編碼基因hisb，由ptrc啟動(dòng)子控制；

14、（9）在假基因位點(diǎn)gapc整合外源的磷酸組氨醇氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因hisc，由ptrc啟動(dòng)子控制；

15、（10）在假基因位點(diǎn)yeel整合外源的5’-profar異構(gòu)酶編碼基因hisa，由ptrc啟動(dòng)子控制；

16、（11）在假基因位點(diǎn)ygay整合外源的igp合成酶編碼基因hisf/h，由ptrc啟動(dòng)子控制；

17、（12）在假基因位點(diǎn)yjgx整合外源的pr-atp焦磷酸水解酶基因hisie，由ptrc啟動(dòng)子控制；

18、（13）在假基因位點(diǎn)yghe整合外源的膜蛋白編碼基因cgl2458，由ptrc啟動(dòng)子控制。

19、進(jìn)一步地，所述ptrc啟動(dòng)子的基因序列為seq?id?no.110所示的序列：

20、ttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagacc；

21、或者，構(gòu)建方法中的步驟（1）至（13）的操作順序并不限制，能夠以本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┑娜魏雾樞蜻M(jìn)行。優(yōu)選地采用如步驟(1)至(13)依次進(jìn)行的方式。

22、進(jìn)一步地，所述crispr/cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)包括構(gòu)建重組片段和pgrb質(zhì)粒，將pgrb質(zhì)粒和所述重組片段同時(shí)轉(zhuǎn)化至含有predcas9的電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞中，以及質(zhì)粒消除的步驟，獲得重組的基因工程菌株。

23、進(jìn)一步地，所述構(gòu)建pgrb質(zhì)粒的方法包括：設(shè)計(jì)靶序列，制備包含靶序列的dna片段，將包含靶序列的dna片段與線性化的載體片段重組；較優(yōu)地，所述靶序列為5’-ngg-3’；

24、或者，所述構(gòu)建重組片段包括構(gòu)建基因整合的重組片段或者構(gòu)建基因敲除的重組片段；其中，構(gòu)建基因整合的重組片段的步驟包括：以出發(fā)菌株的基因組為模板，根據(jù)目的基因擬插入位點(diǎn)的上下游序列設(shè)計(jì)上下游同源臂引物，并根據(jù)目的基因組設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增目的基因片段，再通過pcr重疊技術(shù)獲得重組片段。

25、如上所述的大腸桿菌基因工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)組氨酸中的應(yīng)用。

26、利用如上所述的大腸桿菌基因工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)組氨酸的方法，包括如下步驟：

27、將基因工程菌株與發(fā)酵培養(yǎng)基接觸，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，制備得到組氨酸。

28、進(jìn)一步地，所述發(fā)酵培養(yǎng)包括搖瓶發(fā)酵或者發(fā)酵罐發(fā)酵；

29、搖瓶發(fā)酵時(shí)，先將基因工程菌株從固體斜面接種到含有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，37?℃、180?r/min振蕩培養(yǎng)12?h，然后以10-15%接種量將種子培養(yǎng)物接至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，37℃、180?r/min振蕩培養(yǎng)24?h，發(fā)酵過程中通過補(bǔ)加氨水維持ph在7.0之間以保證菌種正常生長，適時(shí)補(bǔ)加質(zhì)量濃度60%的葡萄糖溶液維持發(fā)酵過程正常進(jìn)行；

30、發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)，用接種環(huán)從-80℃冰箱保菌管中刮取3-5環(huán)菌種，均勻涂布于lb斜面培養(yǎng)基，37?℃培養(yǎng)12?h，轉(zhuǎn)接茄形瓶繼續(xù)培養(yǎng)12-15?h；取無菌水于茄形瓶中，將菌懸液接入種子培養(yǎng)基中，維持發(fā)酵液ph在7.0，溶氧控制在30-35%之間，攪拌轉(zhuǎn)速200-500?r/min，溫度恒定在35?℃培養(yǎng)6?h，培養(yǎng)至發(fā)酵液od600值達(dá)10-15；按照20%接種量接入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基，開始發(fā)酵，發(fā)酵溫度37?℃，攪拌轉(zhuǎn)速300-900?r/min，溶氧控制在25-35%之間，維持ph穩(wěn)定在7.0；當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗完之后，流加質(zhì)量濃度80%的的葡萄糖溶液，維持殘?zhí)堑慕K質(zhì)量濃度為0.1-0.6%，發(fā)酵時(shí)間44?h。

31、進(jìn)一步地，所述種子培養(yǎng)基成分為：25?g/l葡萄糖，5?g/l酵母粉，1?g/l蛋白胨，1.5?g/l檸檬酸，1.8?g/l?k2hpo4，0.5?g/l?mgso4，10?mg/l?feso4，10?mg/l?mnso4，1.0?mg/lvb?mix，其余為水，ph為7.0-7.5，121℃，高壓蒸汽滅菌20?min；

32、所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：20?g/l葡萄糖，4?g/l酵母粉，2?g/l檸檬酸，3.5?g/lk2hpo4，1.8?g/l?mgso4，20?mg/l?feso4，10?mg/l?mnso4，2.0?mg/l?vb?mix，0.2?g/l蛋氨酸，1?g/l味精，其余為水，ph為7.0-7.5，121℃，高壓蒸汽滅菌20min；

33、其中，所述vb?mix均為由質(zhì)量比為1:1:1:1的vb1、vb3、vb5、vb12混合均勻得到的混合物。

34、本發(fā)明取得的優(yōu)點(diǎn)和積極效果為：

35、1、本發(fā)明利用分子生物學(xué)技術(shù)，將高產(chǎn)組氨酸的粘質(zhì)沙雷氏菌突變株中的組氨酸操縱子整合到大腸桿菌基因組中，通過強(qiáng)化前體物prpp供應(yīng)以及組氨酸外排等策略，獲得了一株能夠高產(chǎn)組氨酸的大腸桿菌基因工程菌，提供了相關(guān)的發(fā)酵工藝。利用該菌株替代粘質(zhì)沙雷氏菌用于組氨酸發(fā)酵，可以解決發(fā)酵液粘稠，產(chǎn)物難以提取的問題，具有較好的工業(yè)應(yīng)用潛質(zhì)。

36、2、本發(fā)明使用的粘質(zhì)沙雷氏菌突變株中的組氨酸操縱子，與野生型粘質(zhì)沙雷氏菌中的組氨酸操縱子相比，具有多處突變。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這些突變點(diǎn)對(duì)組氨酸的合成均有正向效果。此外，本發(fā)明使用了新穎的來源于谷氨酸棒桿菌的膜蛋白，能夠有效增強(qiáng)組氨酸向胞外的轉(zhuǎn)運(yùn)。這些改造靶點(diǎn)和元件的挖掘?yàn)榻M氨酸生產(chǎn)菌的構(gòu)建和迭代升級(jí)提供了更多策略。