本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體而言，是關(guān)于一種雙鏈sirna，及其制備方法，藥物組合物和其在制備治療tnf-α介導(dǎo)的疾病或病癥的藥物中的用途。

背景技術(shù)：

1、已上市的rnai藥物中，多以脂質(zhì)納米顆粒和n-乙酰半乳糖胺修飾，靶向肝臟組織。由于sirna分子自身親水性和負(fù)電荷屬性，其難以被細(xì)胞攝取。若要將rnai技術(shù)應(yīng)用于其它組織（如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼、肺），還需要開發(fā)新的技術(shù)，以改善sirna在肝外組織的遞送和分布性能。

2、目前已有研究報(bào)道了不同類別的sirna載體，包括聚合物和多肽等。例如美國專利號(hào)us9061995?b2描述了一種用于遞送核酸（如sirna）的肽綴合物，該綴合物包含一個(gè)細(xì)胞穿透肽部分，旨在提高核酸藥物的細(xì)胞內(nèi)遞送效率。盡管這些肽可以在實(shí)驗(yàn)室條件下展示出良好的效果，但在將其轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用的過程中仍存在諸多難點(diǎn)，細(xì)胞穿透肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性較差，容易被酶降解，導(dǎo)致藥效降低，并且大規(guī)模合成和純化較為復(fù)雜，成本較高。隨著技術(shù)的進(jìn)步，多聚物材料也在開發(fā)中，pei是一種陽離子聚合物，通過與帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合，形成納米級(jí)復(fù)合物，這些復(fù)合物能夠進(jìn)入細(xì)胞并通過內(nèi)吞途徑釋放核酸；plga是一種生物可降解的共聚物，具有良好的生物相容性和可控的降解速率，其可以封裝小核酸藥物，并通過被動(dòng)或主動(dòng)靶向機(jī)制遞送到目標(biāo)組織或細(xì)胞；但某些多聚物可能會(huì)引起免疫反應(yīng)或細(xì)胞毒性，導(dǎo)致不良副作用。

3、更多肝外遞送的藥物一直在開發(fā)中。肺部靶向中，alnylam?pharmaceuticals開發(fā)的aln-hpn-19用于治療肺纖維化，通過吸入方式將小核酸藥物遞送到肺部。眼部靶向中，regeneron?pharmaceuticals開發(fā)的rgx-314用于治療濕性年齡相關(guān)性黃斑變性，通過滴眼液的方式將小核酸藥物遞送到眼睛，這種方式未來還可能治療青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變等疾病。腫瘤靶向中，arrowhead?pharmaceuticals開發(fā)的amg-160用于治療實(shí)體瘤，利用腫瘤微環(huán)境的特性（如ph值、氧化還原狀態(tài)等）設(shè)計(jì)響應(yīng)性遞送系統(tǒng)，將小核酸藥物特異性遞送到腫瘤組織。心臟靶向中，cardior?pharmaceuticals開發(fā)的cardio-rna-001用于治療心力衰竭。腎臟靶向中，使用納米粒子包裹小核酸藥物，通過靜脈注射方式遞送到腎臟組織，用于治療腎病綜合征和慢性腎病，例如silence?therapeutics開發(fā)的sln201用于治療iga腎病。

4、遞送核酸藥物到神經(jīng)系統(tǒng)是一個(gè)極具挑戰(zhàn)性的任務(wù)，因?yàn)檠X屏障的存在使得許多常規(guī)遞送方法難以有效傳遞藥物，但核酸藥物在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面展現(xiàn)出了巨大的潛力，多家企業(yè)正在加大研發(fā)中。voyager?therapeutics的vy-htt01，使用aav（腺相關(guān)病毒）載體遞送sirna，靶向亨廷頓基因（htt），降低突變htt蛋白的表達(dá)，其正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，初步結(jié)果顯示安全性和潛在療效。biogen的spinraza，通過鞘內(nèi)注射遞送反義寡核苷酸（aso），改變smn2基因的剪接，增加功能性smn蛋白的產(chǎn)生，已獲fda批準(zhǔn)，廣泛用于sma患者的治療。acuitas?therapeutics的acu-193，使用脂質(zhì)納米顆粒（lnp）遞送sirna，靶向β-淀粉樣蛋白前體基因（app），降低β-淀粉樣蛋白的產(chǎn)生，處于早期研發(fā)階段。uniqure的amt-130，使用aav載體遞送mirna，靶向突觸核蛋白基因（snca），降低α-突觸核蛋白的表達(dá)，正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，評(píng)估其安全性和有效性。

5、有效遞送小核酸，對(duì)遞送載體的依賴性非常高，許多小核酸藥物的成藥需要建立在開發(fā)出合適的遞送載體之上，這就加大了小核酸成藥的限制。因此，開發(fā)一種有效的無載體sirna肝外遞送技術(shù)是當(dāng)前sirna藥物的研發(fā)重點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、改善藥物的親脂性是提高sirna藥物細(xì)胞攝取、實(shí)現(xiàn)肝外靶向的有效策略。為了改善sirna在肝外組織的無載體遞送和分布性能，本發(fā)明通過對(duì)sirna分子進(jìn)行精細(xì)化的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，增強(qiáng)其親脂性，從而改善其分布性能和遞送效果。

2、本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種核苷，其具有如式（ⅰ）所示的結(jié)構(gòu)，其包含r1，r3和親脂性的r2，其中：

3、（?。?/p>

4、r1選自含氮堿基或含氮堿基類似物；

5、r2選自如下基團(tuán)：

6、、

7、、

8、、

9、、或

10、；

11、r3選自4,4'-二甲氧基三苯甲基（dmtr），4-單甲氧基三苯甲基（mmtr），4,4',4''-三甲氧基三苯甲基（tmtr），特戊酰基氧基甲基（pivom），叔丁基二甲基硅烷基（tbdms），9-芴基甲氧基羰基（fmoc），苯氧基乙酰基（pac），4-叔-丁基苯氧基乙酰基（tbpac），2-氰基乙氧基-n,n-二異丙基氨基膦基（cep），3-乙酰丙?；?，乙?；?，苯甲?；?-氰基乙基，n,n-二丁基氨基羰基（dbf），n,n-二甲基氨基羰基（dmf），異丁?；?，2-(2-硝基苯基)-丙氧羰基（nppoc），三乙基銨（tea），三氟乙?；?，三異丙基甲硅烷氧基甲基（tom），對(duì)異丙基苯氧基乙?；╥prpac），o-縮醛乙酰丙基酯（ale，acetal?levulinyl?ester），苯乙?；?，或1,1',3,3'-四異丙基二硅氧烷基（tetra-isopropyl?disiloxanyl）。

12、本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種雙鏈sirna，其包含一條正義鏈和一條反義鏈，其中的核苷酸具有特殊修飾，所述經(jīng)特殊修飾的核苷酸包含r1和親脂性的r2，具有如式（ⅱ）所示的結(jié)構(gòu)：

13、（ⅱ）

14、r1選自含氮堿基或含氮堿基類似物；

15、r2選自如下基團(tuán)：

16、、

17、、

18、、

19、、或

20、。

21、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)特殊修飾的核苷酸位于正義鏈或反義鏈的5’至3’方向的任意的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。

22、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)特殊修飾的核苷酸位于正義鏈或反義鏈的5’至3’方向的第1，2，5，8，9，10，11，14，17，18或19位中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。

23、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)特殊修飾的核苷酸位于正義鏈的5’至3’方向的第1，2，5，8，14，17，18或19位中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。

24、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)特殊修飾的核苷酸位于反義鏈的5’至3’方向的第1，2，9，10，11，17，18或19位中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。

25、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)特殊修飾的核苷酸位于：

26、正義鏈的5’至3’方向的第1位；

27、正義鏈的5’至3’方向的第1位和第19位；

28、正義鏈的5’至3’方向的第1位和第2位；

29、正義鏈的5’至3’方向的第1，2，18和19位；或

30、正義鏈的5’至3’方向的第1，5，8，14和17位。

31、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)特殊修飾的核苷酸位于：

32、反義鏈的5’至3’方向的第1位；

33、反義鏈的5’至3’方向的第1位和第19位；

34、反義鏈的5’至3’方向的第1位和第2位；

35、反義鏈的5’至3’方向的第1，2，18和19位；或

36、反義鏈的5’至3’方向的第9，10，11，17和18位。

37、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)特殊修飾的核苷酸位于：

38、正義鏈的5’至3’方向的第1位，和反義鏈的5’至3’方向的第1位；

39、正義鏈的5’至3’方向的第1位和第19位，和反義鏈的5’至3’方向的第1位和第19位；

40、正義鏈的5’至3’方向的第1位和第2位，和反義鏈的5’至3’方向的第1位和第2位；

41、正義鏈的5’至3’方向的第1，2，18和19位，和反義鏈的5’至3’方向的第1，2，18和19位；

42、正義鏈的5’至3’方向的第1，5，8，14和17位；或

43、正義鏈的5’至3’方向的第1，5，8，14和17位，和反義鏈的5’至3’方向的第9，10，11，17和18位。

44、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，

45、所述正義鏈的序列為5'-?gccuguagcccauguuguatt?-?3'，所述反義鏈的序列為5'-?uacaacaugggcuacaggctt?-?3’。

46、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述正義鏈或反義鏈的任意的一位或多位的核苷酸單體中與3'-?c連接的磷酸基團(tuán)中的一個(gè)非橋接氧原子被硫原子替代。

47、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述正義鏈的第2，3，4，6，7，9，10，11，12，13，15，16，18和19位核苷酸單體中與3'-?c連接的磷酸基團(tuán)中的一個(gè)非橋接氧原子被硫原子替代。

48、本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種制備如本文任一實(shí)施方案中所述的核苷的方法，所述方法包括親脂鏈的合成以及將親脂鏈與脫水核苷進(jìn)行反應(yīng)得到本文任一實(shí)施方案中所述的核苷，所述脫水核苷選自脫水腺苷或其類似物，脫水尿嘧啶或其類似物，脫水胞嘧啶或其類似物，脫水胸腺嘧啶或其類似物，或脫水鳥嘌呤或其類似物。

49、本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種制備如本文任一實(shí)施方案中所述的雙鏈sirna的方法，所述方法包括以本文任一實(shí)施方案中所述的核苷為原料進(jìn)行rna合成。

50、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述方法為亞磷酰胺三酯法。

51、本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種藥物組合物，其包含治療有效量的如本文任一實(shí)施方案中所述的雙鏈sirna，和藥學(xué)上可接受的載體、溶劑或賦形劑。

52、本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種制備如本文任一實(shí)施方案中所述的藥物組合物的方法，所述方法包括向溶劑中加入雙鏈sirna，和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

53、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括向部分溶劑中加入按終體積計(jì)算的質(zhì)量濃度的0.2~20?mg/ml?雙鏈sirna，0.02~1?mg/ml?二水氯化鈣、0.01~1?mg/ml二氫磷酸鈉、0.01~1?mg/ml六水氯化鎂、0.01~1?mg/ml磷酸鈉、0.01~1?mg/ml氯化鉀，充分溶解后，用溶劑稀釋溶液至接近終體積，所述溶劑為無菌注射用水，最后使用1mg/ml?hcl或naoh溶液將ph調(diào)節(jié)至6.5~7.5。

54、在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括向部分溶劑中加入按終體積計(jì)算的質(zhì)量濃度的2?mg/ml?雙鏈sirna，0.2?mg/ml?二水氯化鈣、0.1?mg/ml二氫磷酸鈉、0.16?mg/ml六水氯化鎂、0.03?mg/ml磷酸鈉、0.22?mg/ml氯化鉀，充分溶解后，用溶劑稀釋溶液至接近終體積，所述溶劑為無菌注射用水，最后使用1?mg/ml?hcl或naoh溶液將ph調(diào)節(jié)至6.9~7.1。

55、本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了如本文任一實(shí)施方案中所述的雙鏈sirna在制備治療tnf-α介導(dǎo)的疾病或病癥的藥物中的用途。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述tnf-α介導(dǎo)的疾病或病癥選自炎癥，自免疾病，痛覺敏感和癌癥。更優(yōu)選地，所述tnf-α介導(dǎo)的疾病或病癥選自銀屑病，銀屑病關(guān)節(jié)炎，脊柱炎，脊髓炎，腦炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，關(guān)節(jié)炎，炎癥性腸病，中樞神經(jīng)過敏，外周神經(jīng)過敏，白血病，淋巴瘤，黑色素瘤，胃癌，肝癌，膽癌，腎癌，肺癌，骨髓瘤，生殖系統(tǒng)癌，乳腺癌，胰腺癌，骨癌或頭頸部腫瘤。

56、本發(fā)明將親脂性碳鏈連接到sirna中核苷酸單體中五碳糖的2’-c端，以增加sirna序列的親脂性，從而改善其無載體遞送效果和分布性能，同時(shí)不會(huì)對(duì)其療效和安全性有負(fù)面影響，具有親脂鏈修飾的sirna能夠更加有效地敲降靶基因的表達(dá)。