本發(fā)明屬于基因工程，具體涉及一種基于一碳單位供應(yīng)的高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌及其構(gòu)建方法，以及所述高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌在微生物發(fā)酵制備d-泛酸中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、泛酸（pantothenic?acid，pa）是維生素b家族中的重要成員，也被稱為維生素b5或遍多酸，是維持生命能量代謝正常的必須維生素。在1933年泛酸首次從酵母中分離出來，其在自然界中廣泛存在于各種食物中，尤其是動物肝臟、蔬菜和全谷類食品中。d-泛酸作為輔酶a（coa）及酰基載體蛋白（acp）的組成部分，參與了脂肪酸合成、蛋白質(zhì)代謝、能量代謝等生物化學(xué)反應(yīng)，具備多種生物學(xué)功能，對于維持正常生理功能至關(guān)重要，廣泛應(yīng)用于制藥行業(yè)、食品行業(yè)、飼料加工和化妝品等行業(yè)，預(yù)計未來幾年其全球市場價值會持續(xù)增長。

2、當(dāng)前，化學(xué)酶法是d-泛酸的主流生產(chǎn)方法，具有底物特異性和反應(yīng)條件溫和性等優(yōu)點，但生產(chǎn)率低、成本高、工業(yè)化困難及生產(chǎn)過程中有毒有害物質(zhì)產(chǎn)生，有悖于綠色發(fā)展理念。與傳統(tǒng)的化工生產(chǎn)方式相比，微生物細胞工廠生產(chǎn)的產(chǎn)品更加環(huán)保，減少了對環(huán)境的污染，符合現(xiàn)代社會對綠色生產(chǎn)的迫切需求。此外這種生產(chǎn)方式還能夠?qū)崿F(xiàn)碳中和，即在生產(chǎn)過程中將排放的碳達到零或負(fù)值，從而減少對大氣中二氧化碳含量的負(fù)面影響，有利于應(yīng)對氣候變化挑戰(zhàn)，提供了一種更環(huán)保且更具經(jīng)濟效益的d-泛酸生產(chǎn)方法。

3、但微生物發(fā)酵法也面臨著菌株選擇、發(fā)酵規(guī)模放大、下游分離純化困難等挑戰(zhàn)，智能、節(jié)約和高效的新一代發(fā)酵工程技術(shù)是未來重要的發(fā)展方向。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中微生物發(fā)酵合成d-泛酸產(chǎn)量不高的技術(shù)問題，本發(fā)明運用crispr-cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，在底盤菌基因組中強化甘氨酸裂解系統(tǒng)與葉酸合成途徑，加強輔因子供應(yīng)；進一步對絲氨酸路徑關(guān)鍵基因的適度強化，合理調(diào)控絲氨酸合成速率，增強碳通量流向d-泛酸的合成，最后通過對d-泛酸合成途徑關(guān)鍵基因進行強化，改善基因工程菌的表達效率，最終得到一株高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌，并將該基因工程菌應(yīng)用于微生物發(fā)酵制備d-泛酸中。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌的構(gòu)建方法，包括：運用crispr-cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，在底盤菌基因組中：強化 pabc基因表達；增加 gcvthp基因拷貝數(shù)并強化表達；弱化 nac基因表達；強化 sera基因、 glya基因的表達并利用apt2#82核糖體開關(guān)動態(tài)調(diào)控 sera基因、 glya基因的表達；增加 panb基因拷貝數(shù)并強化表達，制得高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌。

3、本發(fā)明在底盤菌dpah8（ e.coliw3110,?trc- ecilvd*/ bspanba*?/ cgpanc*?/alss*? /bspanb*?/ nacgtg/δp345ptsh/ gltagtg/ gltattg/trc -ppfkb/trc -gcvthp/ lafu:: folp/yeep::trc-apt2#82- seraglya-ppanb -panb/ gapc::trc- alss*）的基礎(chǔ)上，綜合運用系統(tǒng)代謝工程策略，利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)，對thf合成途徑相關(guān)基因進行強化，將 pabc基因的原位啟動子替換為trc啟動子，增強葉酸合成paba通路，促進葉酸積累，為一碳單位提供甲基載體，在 yeej假基因位點增加trc -gcvthp基因拷貝數(shù)，裂解胞內(nèi)甘氨酸并產(chǎn)生5,10-mthf和nadh，消除甘氨酸抑制，加強輔因子供應(yīng)；下調(diào) nac起始密碼子，解除nac、purr調(diào)控因子對甘氨酸裂解系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄抑制，消除甘氨酸積累，持續(xù)有效地為d-泛酸的合成提供一碳單位。在此基礎(chǔ)上，為繼續(xù)增強碳通量流向d-泛酸的合成，通過啟動子替換增強apt2#82甘氨酸核糖體開關(guān)對 sera、glya基因的實時控制表達，實現(xiàn)對絲氨酸路徑關(guān)鍵基因的適度強化，合理地調(diào)控絲氨酸合成速率。最后，在 tfad假基因位點增加d-泛酸合成途徑關(guān)鍵基因 panb拷貝數(shù)，改善基因工程菌的表達效率，增加d-泛酸的產(chǎn)量，最終得到一株無質(zhì)粒、無抗生素添加用于高產(chǎn)d-泛酸的工程菌株。

4、表1.?基因編輯所涉及的基因及相應(yīng)途徑

5、 基因 涉及途徑 葉酸合成 甘氨酸合成 甘氨酸合成 絲氨酸合成 絲氨酸合成 泛解酸合成

6、作為優(yōu)選，所述強化 pabc基因表達的方法包括：將 pabc基因的原位啟動子替換為trc啟動子。通過強啟動子增強葉酸合成paba通路，促進paba與gtp途徑的結(jié)合，加強葉酸合成，為一碳單位提供甲基載體。

7、作為優(yōu)選，所述增加 gcvthp基因拷貝數(shù)并強化表達的方法包括：在 yeej假基因位點增加受trc啟動子調(diào)控的 gcvthp基因拷貝數(shù)。增強甘氨酸裂解系統(tǒng)，以裂解胞內(nèi)甘氨酸并產(chǎn)生5,10-mthf和nadh，消除甘氨酸抑制，加強輔因子供應(yīng)，增加d-泛酸的合成。

8、作為優(yōu)選，所述弱化 nac基因表達的方法包括，將 nac基因起始密碼子突變?yōu)閠tg。從而解除nac和purr調(diào)控因子對甘氨酸裂解系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄抑制，消除甘氨酸積累，持續(xù)有效地為d-泛酸的合成提供一碳單位。

9、作為優(yōu)選，所述強化 sera基因、 glya基因的表達并利用apt2#82核糖體開關(guān)動態(tài)調(diào)控 sera基因、 glya基因的表達的方法包括：分別將 sera基因、glya基因的原位啟動子替換為trc啟動子，并分別在trc啟動子后插入apt2#82核糖體開關(guān)。從而實現(xiàn)對絲氨酸路徑關(guān)鍵基因的適度強化。該策略能夠合理地調(diào)控絲氨酸合成速率，使胞內(nèi)甘氨酸維持在較低水平，有效促進d-泛酸的合成。

10、作為優(yōu)選，所述增加 panb基因拷貝數(shù)并強化表達的方法包括：在 tfad假基因位點增加受ppanb啟動子調(diào)控的 panb基因拷貝數(shù)。從而改善所述的基因工程菌的表達效率，更好地響應(yīng)甲基供應(yīng)，促進d-泛酸的合成。

11、作為優(yōu)選，所述底盤菌為： e.coliw3110,?trc- ecilvd*/ bspanba*?/ cgpanc*?/ alss*?/bspanb*?/ nacgtg/δp345ptsh/ gltagtg/ gltattg/trc -ppfkb/trc -gcvthp/ lafu:: folp/yeep::trc-apt2#82- sera/apt2#82 glya-ppanb -panb/ gapc::trc- alss*。其中，所述底盤菌的構(gòu)建方法優(yōu)選包括：

12、（1）以工程菌 e.coliw3110,?trc- ecilvd*/ bspanba*?/ cgpanc*?/alss*?/bspanb*/ nacgtg/δp345ptsh/ gltagtg/ gltattg/trc -ppfkb為出發(fā)菌株并將其命名為dpah2，運用crispr-cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，在其基因組中將 gcvthp基因的原位啟動子替換為trc啟動子，刪除轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，得到工程菌dpah3?derivative，trc- gcvthp，記為工程菌dpah3；

13、（2）以工程菌dpah3為出發(fā)菌株，運用crispr-cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，在 lafu假基因位點增加一分子 folp基因拷貝，得到工程菌dpah6?derivative， lafu:: folp，記為工程菌dpah6；

14、（3）以工程菌dpah6為出發(fā)菌株，運用crispr/cas9基因編輯技術(shù)，在基因組上整合 sera與 glya基因簇，在基因簇后再增加一分子 panb基因拷貝，得到工程菌dpah7derivative，yeep::trc-apt2#82- seraglya-ppanb -panb，記為工程菌dpah7；

15、（4）以工程菌dpah7為出發(fā)菌株，運用crispr/cas9基因編輯技術(shù)，在基因組中通過基因敲入方式增加受啟動子ptrc調(diào)控的枯草芽孢桿菌 alss基因拷貝數(shù)，進行密碼子優(yōu)化，得到工程菌dpah8?derivative， gapc::trc- alss*，記為工程菌dpah8，即所述的高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌。

16、作為優(yōu)選，受ptrc啟動子調(diào)控的 pabc基因 、gcvthp基因、 sera基因 、glya基因、 panb基因核苷酸序列分別如seq?id?no.?1、seq?id?no.?2、seq?id?no.?3、seq?id?no.?4、seq.id.no.5所示； nac基因核苷酸序列如seq?id?no.?6所示。

17、更具體地，所述的高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌的構(gòu)建方法包括如下步驟：

18、（1）以工程菌 e.coliw3110,?trc- ecilvd*/ bspanba*?/ cgpanc*?/alss*?/bspanb*/ nacgtg/δp345ptsh/ gltagtg/ gltattg/trc -ppfkb/trc -gcvthp/ lafu:: folp/yeep::trc-apt2#82- sera/apt2#82 glya-ppanb -panb/ gapc::trc- alss*為出發(fā)菌株并將其命名為dpah8，運用crispr-cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，在其基因組中將 pabc基因的原位啟動子替換為trc啟動子，得到工程菌dpah9?derivative，trc- pabc，記為工程菌dpah9；

19、（2）以工程菌dpah9為出發(fā)菌株，運用crispr-cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，在 yeej假基因位點增加 trc-gcvthp基因拷貝數(shù)，得到工程菌dpah10?derivative， yeej:: trc- gcvthp，記為工程菌dpah10；

20、（3）以工程菌dpah10為出發(fā)菌株，運用crispr/cas9基因編輯技術(shù)，在基因組上將 nac起始密碼子突變?yōu)閠tg，得到工程菌dpah11?derivative， nacttg，記為工程菌dpah11；

21、（4）以工程菌dpah11為出發(fā)菌株，運用crispr/cas9基因編輯技術(shù)，在基因組中將 sera原位啟動子替換為trc啟動子，并在啟動子后插入核糖體開關(guān)apt2#82，得到工程菌dpah12?derivative，trc-apt2#82 sera，記為工程菌dpah12；

22、（5）以工程菌dpah12為出發(fā)菌株，運用crispr/cas9基因編輯技術(shù)，在基因組中將 glya原位啟動子替換為trc啟動子，并在啟動子后插入核糖體開關(guān)apt2#82，得到工程菌dpah13?derivative，trc-apt2#82- glya，記為工程菌dpah13；

23、（6）以工程菌dpah13為出發(fā)菌株，運用crispr/cas9基因編輯技術(shù)，在 tfad假基因位點增加 panb基因拷貝數(shù)，得到工程菌dpah14?derivative， tfad::?trc- panb，記為工程菌dpah14，即所述的高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌。

24、本發(fā)明還提供了通過所述的方法構(gòu)建得到的高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌。通過上述方法，本發(fā)明構(gòu)建得到了一株發(fā)酵過程中無質(zhì)粒、無抗生素添加的基因工程菌。作為優(yōu)選，所述高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌為： e.coliw3110,?trc- ecilvd*/ bspanba*?/ cgpanc*?/ alss*?/bspanb*?/ nacgtg/δp345ptsh/ gltagtg/ gltattg/trc -ppfkb/trc -gcvthp/ lafu:: folp/yeep::trc-apt2#82- seraglya-ppanb -panb/ gapc::trc- alss*/trc- pabc?/yeej:: trc- gcvthp/nacttg/trc-apt2#82- sera/trc-apt2#82 glya/ tfad::trc- panb。該菌株搖瓶效價達到7.96g/l，相比出發(fā)菌株提高了16.3%，最終運用5l發(fā)酵罐補料發(fā)酵96小時，d-泛酸產(chǎn)量能夠達到147.3g/l，大幅度提高d-泛酸的合成，縮短了發(fā)酵周期。

25、本發(fā)明還提供了所述的高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌在微生物發(fā)酵制備d-泛酸中的應(yīng)用。

26、作為優(yōu)選，所述應(yīng)用包括：將所述高產(chǎn)d-泛酸的基因工程菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28~37℃、300~450?rpm、ph?6.7~6.9、溶氧10~30%條件下進行補料發(fā)酵培養(yǎng)72~96h，發(fā)酵結(jié)束后分離純化得到所述d-泛酸。

27、作為優(yōu)選，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：葡萄糖10~30g/l、硫酸銨10~25g/l、無水甜菜堿1~5g/l、酵母粉1~5g/l、磷酸二氫鉀1~5g/l、無水硫酸鎂0.5~2g/l、β-丙氨酸1~5g/l，1~5ml/l微量元素溶液，溶劑為去離子水，ph值自然；微量元素溶液組成為：10g/l?cucl2、10g/l?feso4·7h2o、10g/l?znso4·7h2o、0.2g/l?cuso4、0.02g/l?nicl2·7h2o，溶劑為去離子水。

28、作為優(yōu)選，所述應(yīng)用包括：在5?l發(fā)酵罐中裝入體積為1~3?l發(fā)酵培養(yǎng)基，115℃滅菌30?min，將所述基因工程菌菌株接種至1~3?l發(fā)酵培養(yǎng)基中，28~37℃、初始通氣量3~6?l/min、初始攪拌速度300~450?rpm條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)，氨水調(diào)節(jié)ph，同時添加終濃度為0.1~0.4?mm的iptg，終濃度為5?mg/l?vb1、2?mg/l?vb12，以及10~40?g/l異亮氨酸5~10?ml；發(fā)酵過程中使用溶氧串聯(lián)轉(zhuǎn)速將溶氧維持10%~30%，用氨水作中和劑維持ph?6.7~6.9，通過ph聯(lián)動補料將補料培養(yǎng)基加入罐內(nèi)，葡萄糖濃度控制在5g/l以下，28~37℃培養(yǎng)72~96小時，得到發(fā)酵液，取發(fā)酵液上清分離純化得到所述d-泛酸。其中，所述補料培養(yǎng)基組成如下：葡萄糖500g/l、硫酸銨5~25g/l、無水甜菜堿2~8g/l、酵母粉1~5g/l、磷酸二氫鉀10~20g/l、無水硫酸鎂5~15g/l、β-丙氨酸40~100g/l，1~5?ml/l微量元素溶液，溶劑為去離子水，ph值自然。

29、本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明運用crispr/cas9基因編輯技術(shù)，在現(xiàn)有工程菌dpah8的基礎(chǔ)上強化甘氨酸裂解系統(tǒng)與葉酸合成途徑，加強輔因子供應(yīng)；進一步對絲氨酸路徑關(guān)鍵基因的適度強化，合理調(diào)控絲氨酸合成速率，增強碳通量流向d-泛酸的合成，最后通過對d-泛酸合成途徑關(guān)鍵基因進行強化，改善基因工程菌的表達效率，顯著增加了d-泛酸的產(chǎn)量，最終得到一株無質(zhì)粒、無抗生素添加用于高產(chǎn)d-泛酸的高產(chǎn)菌株；本發(fā)明菌株搖瓶效價達到7.96g/l，相比出發(fā)菌株提高了16.3%，最終運用5?l發(fā)酵罐發(fā)酵96小時，d-泛酸產(chǎn)量達到147.3?g/l，大幅度提高了d-泛酸的合成。