本發(fā)明涉及基因編輯領(lǐng)域，更具體涉及一種編輯tim3基因獲得功能強(qiáng)化的car-nk細(xì)胞的方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、基因編輯技術(shù)，尤其是crispr/cas9系統(tǒng)，為精確修改生物體的遺傳物質(zhì)提供了強(qiáng)大的工具。crispr/cas9技術(shù)允許研究人員通過設(shè)計(jì)特定的單鏈引導(dǎo)rna?(sgrna)來(lái)引導(dǎo)cas9核酸酶到基因組中的特定位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)精確的dna切割。這種系統(tǒng)的高效性、靈活性和精確性使其成為基因編輯的首選工具。然而，crispr/cas9技術(shù)也存在挑戰(zhàn)，包括脫靶效應(yīng)（即cas9在非目標(biāo)位點(diǎn)切割dna）和編輯效率及特異性的優(yōu)化問題。

2、在基因編輯過程中，往往會(huì)選擇“安全位點(diǎn)(safe?harbor)”進(jìn)行編輯?！鞍踩稽c(diǎn)(safe?harbor)”是指那些在基因組中特定位置具有較低突變率和較高遺傳穩(wěn)定性的區(qū)域，因此在基因編輯中選擇這些位點(diǎn)進(jìn)行操作可以減少非目標(biāo)效應(yīng)，提高基因編輯的安全性和有效性。例如，rosa26位點(diǎn)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的“safe?harbor”位點(diǎn)，它在小鼠基因組中提供了一個(gè)安全的位置，用于外源基因的插入和表達(dá)，而不會(huì)影響小鼠的正常發(fā)育和繁殖。除了rosa26位點(diǎn)，還有其他一些位點(diǎn)，如h11、tigre、col1a1等，也被證明是安全的插入位點(diǎn)，可以用于基因的穩(wěn)定表達(dá)。在人類第19號(hào)染色體上的aavs1位點(diǎn)也被認(rèn)為是一個(gè)安全位點(diǎn)，用于通過crispr-cas9介導(dǎo)的同源重組(hr)反應(yīng)將目的基因、篩選標(biāo)記或其他遺傳因子整合到人類基因組中，確保轉(zhuǎn)入基因長(zhǎng)期、穩(wěn)定的表達(dá)。

3、然而，當(dāng)需要對(duì)干細(xì)胞例如誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced?pluripotent?stemcells,?ips?cells,?ipsc)進(jìn)行基因編輯時(shí)，一方面，與永生細(xì)胞系相比，干細(xì)胞中定向同源重組修復(fù)(hdr)的效率低，而hdr是外源供體dna用于修復(fù)crispr誘導(dǎo)的雙鏈斷裂的主要方法；另一方面，基因編輯可能會(huì)影響干細(xì)胞的多能性標(biāo)志物表達(dá)和分化潛力，可能影響干細(xì)胞分化過程中nk細(xì)胞的成熟階段和功能表達(dá)，進(jìn)而影響其殺傷腫瘤細(xì)胞的能力；故僅在安全位點(diǎn)進(jìn)行基因編輯，對(duì)于干細(xì)胞及其分化為nk細(xì)胞的需求仍然需要進(jìn)一步提升其編輯效率，或者降低基因編輯對(duì)干細(xì)胞分化為nk細(xì)胞的過程乃至對(duì)nk細(xì)胞功能的不利影響。

4、因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種針對(duì)干細(xì)胞的新型基因編輯方法，以期降低基因編輯對(duì)干細(xì)胞分化為nk細(xì)胞的過程乃至對(duì)nk細(xì)胞功能的不利影響，甚至起到增強(qiáng)nk細(xì)胞功能的效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的就是提供一種針對(duì)干細(xì)胞的新型基因編輯方法，以增強(qiáng)nk細(xì)胞功能并獲得功能增強(qiáng)的nk細(xì)胞。

2、在本發(fā)明的第一方面，提供了一種針對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行基因編輯以分化獲得功能增強(qiáng)的nk細(xì)胞的方法，所述方法包括步驟：

3、(z1)?利用基因編輯技術(shù)在干細(xì)胞基因組的tim3基因位點(diǎn)敲入外源目的基因，和/或利用基因編輯技術(shù)在干細(xì)胞基因組中敲除tim3基因或tim3基因片段；和

4、(z2)?誘導(dǎo)基因編輯后的干細(xì)胞分化為nk細(xì)胞，從而獲得功能增強(qiáng)的nk細(xì)胞。

5、在另一優(yōu)選例中，所述方法為體外方法。

6、在另一優(yōu)選例中，所述方法為非疾病治療目的、非疾病診斷目的。

7、在另一優(yōu)選例中，所述干細(xì)胞選自下組：誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(ipsc)、胚胎干細(xì)胞(esc)、造血干細(xì)胞(hsc)、間充質(zhì)干細(xì)胞，或其組合；較佳地，所述干細(xì)胞選自下組：誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(ipsc)、胚胎干細(xì)胞(esc)、造血干細(xì)胞(hsc)，或其組合；更佳地，所述干細(xì)胞為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(ipsc)。

8、在另一優(yōu)選例中，所述步驟(z1)包括：利用基因編輯技術(shù)在干細(xì)胞基因組的tim3基因位點(diǎn)敲入外源目的基因，同時(shí)敲除tim3基因。

9、在另一優(yōu)選例中，所述基因編輯技術(shù)為crispr/cas9、talen。

10、在另一優(yōu)選例中，所述基因編輯技術(shù)使用sgrna，所述sgrna的轉(zhuǎn)錄模版序列如seqid?no:?1所示。

11、在另一優(yōu)選例中，所述ipsc來(lái)源于選自下組的細(xì)胞：人成纖維細(xì)胞、人外周血單個(gè)核細(xì)胞、人造血干細(xì)胞等人體來(lái)源的分化細(xì)胞，或其組合。

12、在另一優(yōu)選例中，所述外源目的基因包括：治療性基因、報(bào)告基因、自殺基因、免疫調(diào)節(jié)基因，或其組合。

13、在另一優(yōu)選例中，所述外源目的基因包括嵌合抗原受體(car)基因。

14、在另一優(yōu)選例中，所述car靶向腫瘤表面抗原。

15、在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤表面抗原包括但不限于：cd19、cd20、pd-1、pd-l1、claudin?18.2、bcma、cd22、cd24、cd25、cd30、cd33、cd38、cd44、cd52、cd56、cd70、cd96、cd97、cd99、cd123、egfr、her2、her3、cd117、c-met、egfr、egfrviii、erbb3、erbb4、vegfr1、vegfr2、ror1、pthr2、b7-h1?(pd-l1)、b7-h2、b7-h3、b7-h4、b7-h5、b7-h6、b7-h7、trop-2、gpc-3、epcam、dll-3、nectin-4、claudin6、muc-1、psma、gd3、fap、cea、epha2、ctla-4、lag-3、tigit、msln，或其組合。

16、在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤表面抗原為cd19。

17、在另一優(yōu)選例中，所述外源目的基因包括靶向cd19的嵌合抗原受體(car)基因。

18、在另一優(yōu)選例中，所述car具有如下式i所示的結(jié)構(gòu)：

19、l-eb-h-tm-c-cd3ζ???(i)

20、式中，

21、各“-”獨(dú)立地為連接肽或肽鍵；

22、l為無(wú)或任選的信號(hào)肽序列；

23、eb為靶向腫瘤表面抗原的胞外結(jié)合域；

24、h為任選的鉸鏈區(qū)；

25、tm為跨膜結(jié)構(gòu)域；

26、c為共刺激信號(hào)分子；

27、cd3ζ為源于cd3ζ的胞漿信號(hào)傳導(dǎo)序列。

28、在另一優(yōu)選例中，所述l是本領(lǐng)域常用的免疫細(xì)胞表面分子的信號(hào)肽，優(yōu)選為選自下組的蛋白的信號(hào)肽：cd8、cd28、gm-csf、cd4、cd137、nkg2d，或其組合。

29、在另一優(yōu)選例中，所述eb為抗cd19抗體或其抗原結(jié)合片段。

30、在另一優(yōu)選例中，所述eb為fmc63抗體的scfv。

31、在另一優(yōu)選例中，所述eb包括fmc63抗體的重鏈和輕鏈。

32、在另一優(yōu)選例中，所述h是選自下組的蛋白的鉸鏈區(qū)：cd8（包括cd8α）、cd28、cd137、nkg2d、2b4、dap10、dap12，或其組合。

33、在另一優(yōu)選例中，所述h為cd28蛋白的鉸鏈區(qū)。

34、在另一優(yōu)選例中，所述tm是本領(lǐng)域常用的免疫細(xì)胞表面分子的跨膜區(qū)，優(yōu)選為選自下組的蛋白的跨膜區(qū)：cd28、cd3?epsilon、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、nkg2d、2b4、dap10、dap12，或其組合。

35、在另一優(yōu)選例中，所述tm為cd28蛋白的跨膜區(qū)。

36、在另一優(yōu)選例中，所述c是選自下組的蛋白的共刺激信號(hào)分子：ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd134、4-1bb?(cd137)、pd1、dap10、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos?(cd278)、nkg2d、gitr、tlr2，2b4、dap10、dap12，或其組合。

37、在另一優(yōu)選例中，所述c為cd28蛋白的共刺激信號(hào)分子。

38、在另一優(yōu)選例中，所述外源目的基因還包括：?jiǎn)?dòng)子、polya、選擇性標(biāo)記，或其組合。

39、在另一優(yōu)選例中，所述選擇性標(biāo)記包括：報(bào)告基因、抗性基因，或其組合。

40、在另一優(yōu)選例中，所述tim3基因的cdna序列如seq?id?no:?4所示。

41、在另一優(yōu)選例中，所述tim3基因位點(diǎn)選自下組：tim3外顯子1位點(diǎn)、tim3外顯子2位點(diǎn)、tim3外顯子3位點(diǎn)、tim3外顯子4位點(diǎn)、tim3外顯子5位點(diǎn)、tim3外顯子6位點(diǎn)、tim3外顯子7位點(diǎn)，或其組合。

42、在另一優(yōu)選例中，所述tim3基因位點(diǎn)為tim3外顯子1位點(diǎn)。

43、在另一優(yōu)選例中，所述tim3外顯子1的序列如seq?id?no:?5所示。

44、在另一優(yōu)選例中，所述car的序列如seq?id?no:?6所示。

45、在另一優(yōu)選例中，所述步驟(z2)包括：

46、(i)?將car-ipsc投料到生物反應(yīng)器中進(jìn)行3d培養(yǎng)，形成球形的ipsc團(tuán)塊；和

47、(ii)?通過添加特定的細(xì)胞因子組合物，誘導(dǎo)ipsc進(jìn)行通過如下的細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)換進(jìn)行定向分化：經(jīng)過ipsc到造血干細(xì)胞(hsc)，再到淋巴祖細(xì)胞，最后獲得cd3-cd56+為特征的ipsc-car-nk細(xì)胞。

48、在另一優(yōu)選例中，所述ipsc到造血干細(xì)胞(hsc)的步驟包括添加選自下組的細(xì)胞因子：scf、vegf、bmp4，或其組合。

49、在另一優(yōu)選例中，所述淋巴祖細(xì)胞到ipsc-car-nk細(xì)胞的步驟包括添加選自下組的細(xì)胞因子：il3、il7、il15、scf、flt3l，或其組合。

50、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：對(duì)基因編輯后的ipsc進(jìn)行驗(yàn)證或鑒定的步驟。

51、在另一優(yōu)選例中，所述驗(yàn)證或鑒定包括但不限于：pcr驗(yàn)證、測(cè)序、功能鑒定，或其組合。

52、在另一優(yōu)選例中，所述驗(yàn)證或鑒定包括：使用跨同源臂的上下游引物進(jìn)行驗(yàn)證或鑒定。

53、在另一優(yōu)選例中，所述上下游引物包括如seq?id?no:?2所示的ha-l序列和如seqid?no:?3所示的ha-r序列。

54、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：對(duì)ipsc進(jìn)行擴(kuò)增的步驟。

55、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：對(duì)nk細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增的步驟。

56、在另一優(yōu)選例中，所述nk細(xì)胞包括cd3-cd56+?nk細(xì)胞。

57、在另一優(yōu)選例中，所述nk細(xì)胞為cd3-cd56+?nk細(xì)胞。

58、在另一優(yōu)選例中，所述nk細(xì)胞為car-nk細(xì)胞。

59、在另一優(yōu)選例中，（與未經(jīng)改造的nk細(xì)胞相比，或者與由未經(jīng)改造的ipsc分化而來(lái)的nk細(xì)胞相比）所述功能增強(qiáng)的nk細(xì)胞具有選自下組的一種或多種特征：

60、(a)?增強(qiáng)的靶細(xì)胞殺傷能力；

61、(b)?減少的nk細(xì)胞凋亡比例；

62、(c)?在殺傷靶細(xì)胞過程中增強(qiáng)的存續(xù)能力；

63、(d)?改善的耗竭特性。

64、在另一優(yōu)選例中，所述殺傷能力包括特異性殺傷能力。

65、在另一優(yōu)選例中，所述nk細(xì)胞凋亡為nk細(xì)胞自發(fā)凋亡。

66、在另一優(yōu)選例中，所述(d)?改善的耗竭特性包括：

67、(i)?抑制性受體nkg2a的表達(dá)減少；和/或

68、(ii)?激活受體nkp46的表達(dá)增加。

69、在另一優(yōu)選例中，所述靶細(xì)胞為癌癥細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。

70、在另一優(yōu)選例中，所述癌癥或腫瘤包括：血液腫瘤、實(shí)體瘤，或其組合。

71、在另一優(yōu)選例中，所述癌癥或腫瘤包括但不限于：白血病、淋巴瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、多發(fā)性骨髓瘤、腎癌、胰腺癌、黑色素瘤、甲狀腺癌、腦腫瘤、皮膚癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、頭頸癌、膀胱癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤，或其組合。

72、在另一優(yōu)選例中，所述癌癥或腫瘤包括：慢性髓細(xì)胞性白血病。

73、在本發(fā)明的第二方面，提供了一種由如本發(fā)明第一方面所述的方法制備的nk細(xì)胞。

74、在另一優(yōu)選例中，所述nk細(xì)胞包括擴(kuò)增獲得的nk細(xì)胞。

75、在另一優(yōu)選例中，所述nk細(xì)胞包括cd3-cd56+?nk細(xì)胞。

76、在另一優(yōu)選例中，所述nk細(xì)胞為cd3-cd56+?nk細(xì)胞。

77、在另一優(yōu)選例中，所述nk細(xì)胞為car-nk細(xì)胞。

78、在另一優(yōu)選例中，（與未經(jīng)改造的nk細(xì)胞相比，或者與由未經(jīng)改造的ipsc分化而來(lái)的nk細(xì)胞相比）所述nk細(xì)胞具有選自下組的一種或多種特征：

79、(a)?增強(qiáng)的靶細(xì)胞殺傷能力；

80、(b)?減少的nk細(xì)胞凋亡比例；

81、(c)?在殺傷靶細(xì)胞過程中增強(qiáng)的存續(xù)能力；

82、(d)?改善的耗竭特性。

83、在另一優(yōu)選例中，所述殺傷能力包括特異性殺傷能力。

84、在另一優(yōu)選例中，所述nk細(xì)胞凋亡為nk細(xì)胞自發(fā)凋亡。

85、在另一優(yōu)選例中，所述(d)?改善的耗竭特性包括：

86、(i)?抑制性受體nkg2a的表達(dá)減少；和/或

87、(ii)?激活受體nkp46的表達(dá)增加。

88、在本發(fā)明的第三方面，提供了一種針對(duì)干細(xì)胞的基因編輯方法，所述方法包括步驟：利用基因編輯技術(shù)在干細(xì)胞基因組的tim3基因位點(diǎn)敲入外源目的基因，和/或利用基因編輯技術(shù)在干細(xì)胞基因組中敲除tim3基因或tim3基因片段。

89、在另一優(yōu)選例中，所述方法為體外方法。

90、在另一優(yōu)選例中，所述方法為非疾病治療目的、非疾病診斷目的。

91、在另一優(yōu)選例中，所述干細(xì)胞選自下組：誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(ipsc)、胚胎干細(xì)胞(esc)、造血干細(xì)胞(hsc)、間充質(zhì)干細(xì)胞，或其組合；較佳地，所述干細(xì)胞選自下組：誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(ipsc)、胚胎干細(xì)胞(esc)、造血干細(xì)胞(hsc)，或其組合；更佳地，所述干細(xì)胞為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(ipsc)。

92、在另一優(yōu)選例中，所述方法包括：利用基因編輯技術(shù)在干細(xì)胞基因組的tim3基因位點(diǎn)敲入外源目的基因，同時(shí)敲除tim3基因。

93、在另一優(yōu)選例中，所述基因編輯技術(shù)為crispr/cas9、talen。

94、在另一優(yōu)選例中，所述基因編輯技術(shù)使用sgrna，所述sgrna的轉(zhuǎn)錄模版序列如seqid?no:?1所示。

95、在另一優(yōu)選例中，所述ipsc來(lái)源于選自下組的細(xì)胞：人成纖維細(xì)胞、人外周血單個(gè)核細(xì)胞、人造血干細(xì)胞等人體來(lái)源的分化細(xì)胞，或其組合。

96、在另一優(yōu)選例中，所述外源目的基因包括：治療性基因、報(bào)告基因、自殺基因、免疫調(diào)節(jié)基因，或其組合。

97、在另一優(yōu)選例中，所述外源目的基因包括嵌合抗原受體(car)基因。

98、在另一優(yōu)選例中，所述car靶向腫瘤表面抗原。

99、在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤表面抗原包括但不限于：cd19、cd20、pd-1、pd-l1、claudin?18.2、bcma、cd22、cd24、cd25、cd30、cd33、cd38、cd44、cd52、cd56、cd70、cd96、cd97、cd99、cd123、egfr、her2、her3、cd117、c-met、egfr、egfrviii、erbb3、erbb4、vegfr1、vegfr2、ror1、pthr2、b7-h1?(pd-l1)、b7-h2、b7-h3、b7-h4、b7-h5、b7-h6、b7-h7、trop-2、gpc-3、epcam、dll-3、nectin-4、claudin6、muc-1、psma、gd3、fap、cea、epha2、ctla-4、lag-3、tigit、msln，或其組合。

100、在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤表面抗原為cd19。

101、在另一優(yōu)選例中，所述外源目的基因包括靶向cd19的嵌合抗原受體(car)基因。

102、在另一優(yōu)選例中，所述car具有如下式i所示的結(jié)構(gòu)：

103、l-eb-h-tm-c-cd3ζ???(i)

104、式中，

105、各“-”獨(dú)立地為連接肽或肽鍵；

106、l為無(wú)或任選的信號(hào)肽序列；

107、eb為靶向腫瘤表面抗原的胞外結(jié)合域；

108、h為任選的鉸鏈區(qū)；

109、tm為跨膜結(jié)構(gòu)域；

110、c為共刺激信號(hào)分子；

111、cd3ζ為源于cd3ζ的胞漿信號(hào)傳導(dǎo)序列。

112、在另一優(yōu)選例中，所述l是本領(lǐng)域常用的免疫細(xì)胞表面分子的信號(hào)肽，優(yōu)選為選自下組的蛋白的信號(hào)肽：cd8、cd28、gm-csf、cd4、cd137、nkg2d，或其組合。

113、在另一優(yōu)選例中，所述eb為抗cd19抗體或其抗原結(jié)合片段。

114、在另一優(yōu)選例中，所述eb為fmc63抗體的scfv。

115、在另一優(yōu)選例中，所述eb包括fmc63抗體的重鏈和輕鏈。

116、在另一優(yōu)選例中，所述h是選自下組的蛋白的鉸鏈區(qū)：cd8（包括cd8α）、cd28、cd137、nkg2d、2b4、dap10、dap12，或其組合。

117、在另一優(yōu)選例中，所述h為cd28蛋白的鉸鏈區(qū)。

118、在另一優(yōu)選例中，所述tm是本領(lǐng)域常用的免疫細(xì)胞表面分子的跨膜區(qū)，優(yōu)選為選自下組的蛋白的跨膜區(qū)：cd28、cd3?epsilon、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、nkg2d、2b4、dap10、dap12，或其組合。

119、在另一優(yōu)選例中，所述c是選自下組的蛋白的共刺激信號(hào)分子：ox40、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd70、cd134、4-1bb?(cd137)、pd1、dap10、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos?(cd278)、nkg2d、gitr、tlr2、2b4、dap10、dap12，或其組合。

120、在另一優(yōu)選例中，所述c為cd28蛋白的共刺激信號(hào)分子。

121、在另一優(yōu)選例中，所述外源目的基因還包括：?jiǎn)?dòng)子、polya、選擇性標(biāo)記，或其組合。

122、在另一優(yōu)選例中，所述選擇性標(biāo)記包括：報(bào)告基因、抗性基因，或其組合。

123、在另一優(yōu)選例中，所述tim3基因的cdna序列如seq?id?no:?4所示。

124、在另一優(yōu)選例中，所述tim3基因位點(diǎn)選自下組：tim3外顯子1位點(diǎn)、tim3外顯子2位點(diǎn)、tim3外顯子3位點(diǎn)、tim3外顯子4位點(diǎn)、tim3外顯子5位點(diǎn)、tim3外顯子6位點(diǎn)、tim3外顯子7位點(diǎn)，或其組合。

125、在另一優(yōu)選例中，所述tim3基因位點(diǎn)為tim3外顯子1位點(diǎn)。

126、在另一優(yōu)選例中，所述tim3外顯子1的序列如seq?id?no:?5所示。

127、在另一優(yōu)選例中，所述car的序列如seq?id?no:?6所示。

128、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：對(duì)基因編輯后的ipsc進(jìn)行驗(yàn)證或鑒定的步驟。

129、在另一優(yōu)選例中，所述驗(yàn)證或鑒定包括但不限于：pcr驗(yàn)證、測(cè)序、功能鑒定，或其組合。

130、在另一優(yōu)選例中，所述驗(yàn)證或鑒定包括：使用跨同源臂的上下游引物進(jìn)行驗(yàn)證或鑒定。

131、在另一優(yōu)選例中，所述上下游引物包括如seq?id?no:?2所示的ha-l序列和如seqid?no:?3所示的ha-r序列。

132、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：對(duì)ipsc進(jìn)行擴(kuò)增的步驟。

133、在本發(fā)明的第四方面，提供了一種由如本發(fā)明第三方面所述的方法制備的干細(xì)胞。

134、在另一優(yōu)選例中，所述干細(xì)胞選自下組：誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(ipsc)、胚胎干細(xì)胞(esc)、造血干細(xì)胞(hsc)、間充質(zhì)干細(xì)胞，或其組合；較佳地，所述干細(xì)胞選自下組：誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(ipsc)、胚胎干細(xì)胞(esc)、造血干細(xì)胞(hsc)，或其組合；更佳地，所述干細(xì)胞為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(ipsc)。

135、在另一優(yōu)選例中，所述ipsc包括擴(kuò)增獲得的ipsc。

136、在另一優(yōu)選例中，所述干細(xì)胞為非動(dòng)物品系、非植物品系。

137、在本發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括：如本發(fā)明第二方面所述的nk細(xì)胞，和藥學(xué)上可接受的載體。

138、在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物為制劑。

139、在另一優(yōu)選例中，所述藥物組合物還包括其他用于治療或預(yù)防腫瘤的藥物。

140、在另一優(yōu)選例中，所述其他用于治療腫瘤的藥物包括：特異性識(shí)別腫瘤抗原的抗體或抗體片段、特異性識(shí)別病毒靶標(biāo)蛋白的藥物，或其組合。

141、在本發(fā)明的第六方面，提供了一種制劑，所述制劑包括：如本發(fā)明第四方面所述的干細(xì)胞，和藥學(xué)上可接受的輔料。

142、在另一優(yōu)選例中，所述干細(xì)胞選自下組：誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(ipsc)、胚胎干細(xì)胞(esc)、造血干細(xì)胞(hsc)、間充質(zhì)干細(xì)胞，或其組合；較佳地，所述干細(xì)胞選自下組：誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(ipsc)、胚胎干細(xì)胞(esc)、造血干細(xì)胞(hsc)，或其組合；更佳地，所述干細(xì)胞為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(ipsc)。

143、在本發(fā)明的第七方面，提供了一種如本發(fā)明第二方面所述的nk細(xì)胞、如本發(fā)明第四方面所述的干細(xì)胞、如本發(fā)明第五方面所述的藥物組合物，或如本發(fā)明第六方面所述的制劑的用途，用于制備用于免疫療法的藥物。

144、在另一優(yōu)選例中，所述藥物施用于癌癥或腫瘤患者。

145、在另一優(yōu)選例中，所述癌癥或腫瘤包括：血液腫瘤、實(shí)體瘤，或其組合。

146、在另一優(yōu)選例中，所述癌癥或腫瘤包括但不限于：白血病、淋巴瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、多發(fā)性骨髓瘤、腎癌、胰腺癌、黑色素瘤、甲狀腺癌、腦腫瘤、皮膚癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌、頭頸癌、膀胱癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤，或其組合。

147、在另一優(yōu)選例中，所述癌癥或腫瘤包括：慢性髓細(xì)胞性白血病。

148、在本發(fā)明的第八方面，提供了一種如本發(fā)明第四方面所述的干細(xì)胞，或如本發(fā)明第六方面所述的制劑的用途，用于制備nk細(xì)胞。

149、在另一優(yōu)選例中，所述nk細(xì)胞為如本發(fā)明第二方面所述的nk細(xì)胞。

150、在本發(fā)明的第九方面，提供了一種治療方法，所述方法包括步驟：向需要的受試者施用如本發(fā)明第二方面所述的nk細(xì)胞，或如本發(fā)明第五方面所述的藥物組合物。

151、應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。