本發(fā)明屬于細胞外囊泡制備，涉及一種球根植物細胞外囊泡及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、細胞外囊泡是一類具有脂質(zhì)膜包被的囊泡，其內(nèi)包裹著蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等活性大分子，由細胞分泌到質(zhì)外體，對細胞間的交流至關(guān)重要。植物細胞外囊泡具有豐富的核酸、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)。與動物來源的細胞外囊泡相比，植物細胞外囊泡因來源于可食用植物，因此不僅無毒，且產(chǎn)率高、生物相容性好、具有非免疫原性。研究表明，從多種可食用植物中提取的細胞外囊泡具備抗炎、抗癌、抗病毒、抗氧化等多種治療作用，具有研發(fā)為藥物制劑并高效治療一系列疾病的藥用潛力。此外，具有生物活性的植物細胞外囊泡還可作為載體遞送核酸、多糖、蛋白質(zhì)等生物大分子，用于封裝藥物并協(xié)同增強其治療效果。

2、現(xiàn)有技術(shù)中，植物來源細胞外囊泡多提取自富含汁液的水果或花朵、葉片等組織。以百合、石蒜等球根植物為代表的具有膨大地下貯藏器官的多年生植物通常淀粉含量高，破壁后汁液少且粘稠，難以通過常規(guī)細胞外囊泡提取方法獲得球根植物細胞外囊泡。且百合、石蒜、黃精等具膨大地下貯藏器官的中草藥通常需經(jīng)風(fēng)干、炮制后方才發(fā)揮療效，但風(fēng)干、炮制是否會導(dǎo)致所得細胞外囊泡純度、粒度、形態(tài)和成分發(fā)生變化，目前尚不明確。因此，迫切需要一種針對具膨大地下貯藏器官的多年生植物的、簡單且高效制備高質(zhì)量細胞外囊泡的方法。

3、中國發(fā)明專利cn114540271a提供了一種植物外泌體的純化方法，包括：收集植物細胞破碎液，離心收集上清液；向上清液中加入沉淀液，得混合液；將混合液離心，棄上清，收集沉淀，加入pbs完全溶解沉淀，得溶解液；將溶解液進行凝膠過濾層析分離，即得外泌體。該方法通過peg-8000沉淀與凝膠過濾層析聯(lián)合實現(xiàn)大規(guī)模和高純度外泌體的分離純化，能夠同時保證外泌體的含量、純度、生物活性，所分離的外泌體產(chǎn)量高，純度高；效率高，操作簡單，易大規(guī)模生產(chǎn)。但是該技術(shù)沒有提供一種針對淀粉含量高、汁液量少粘稠的鱗莖植物中細胞外囊泡的提取方法。

4、中國發(fā)明專利cn118424819a提供了一種植物外泌體及其提取方法，將植物莖葉破壁后通過過濾、低速離心、微孔濾膜過濾、超速離心、重懸、超速離心、重懸、微孔濾膜過濾分離得到植物外泌體。采用該技術(shù)植物外泌體的提取方法提取淫羊藿外泌體，提取過程使用的試劑種類單一，儀器數(shù)量少，無需大量的細胞培養(yǎng)液即可獲得尺寸在130nm左右的淫羊藿外泌體。并且淫羊藿外泌體的產(chǎn)率和純度均較高，從150g淫羊藿莖葉中約可提取出5×1012個外泌體，且粒徑分布均勻，集中于130nm，有利于后續(xù)生產(chǎn)或研究。但是該技術(shù)沒有提供一種針對淀粉含量高、汁液量少粘稠的植物膨大地下貯藏器官中細胞外囊泡的提取方法。

5、中國發(fā)明專利cn118546855a提供了一種植物外泌體及其提取方法。所述的植物外泌體的提取方法包括：（a）向植物組織勻漿中加入蛋白酶抑制劑，得到初榨汁液；將初榨汁液進行連續(xù)離心處理，取上清，得到預(yù)處理汁液；（b）將聚乙二醇和葡聚糖添加至預(yù)處理汁液后進行震蕩處理和第一離心，收集下層的納米顆粒懸液；（c）將納米顆粒懸液進行尺寸排阻色譜，收集目標(biāo)產(chǎn)物；（d）可選地，將聚乙二醇和目標(biāo)產(chǎn)物混勻后進行孵育和第二離心，收集沉淀產(chǎn)物。所述的植物外泌體的提取方法，具有普適性，簡單快捷，無需特殊設(shè)備，易于控制，可得到大小均勻的外泌體，所獲得的外泌體具有較高的濃度，成本低，可適用于大規(guī)模生產(chǎn)。但是該技術(shù)沒有提供一種針對淀粉含量高、汁液量少粘稠的鱗莖植物中細胞外囊泡的提取方法。

6、總之，現(xiàn)有技術(shù)尚不能提供一種淀粉含量高、汁液量少粘稠的植物地下膨大器官中更高效的細胞外囊泡提取方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，針對現(xiàn)有技術(shù)尚不能提供一種淀粉含量高、汁液量少粘稠的植物地下膨大器官中更高效的細胞外囊泡的提取方法的問題，本發(fā)明提供了一種球根植物細胞外囊泡及其制備方法和應(yīng)用。

2、為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種球根植物細胞外囊泡的制備方法，包括以下步驟：

3、s1、將球根植物組織與緩沖溶液混合，粉碎，過濾，得植物原液；

4、s2、將步驟s1得到的植物原液進行處理，得植物清液；

5、s3、將步驟s2得到的植物清液于3-5℃、110000-130000g的條件下離心80-100min，保留沉淀，使用緩沖溶液重懸沉淀，重復(fù)1-2次，得重懸液；

6、s4、將步驟s3得到的重懸液過濾，濾液濃縮，得球根植物細胞外囊泡；

7、其中，所述球根植物組織選自百合或石蒜；

8、步驟s2中所述處理包括以下步驟：

9、s201、將步驟s1得到的植物原液于3-5℃、900-1100g離心8-12min，得上清液1；

10、s202、將步驟s201得到的上清液1于3-5℃、2900-3100g離心18-22min，得上清液2；

11、s203、將步驟s202得到的上清液2與半纖維素酶、果膠酶和纖維素酶混合，得酶混合液，室溫靜置消化2-3小時獲得上清液3，于3-5℃、4900-5100g離心100-140min，得上清液3；

12、s204、將步驟s203得到的上清液3使用濾膜過濾，得濾液1；

13、s205、將步驟s204得到的濾液1于3-5℃、19000-21000g離心80-100min，得上清液4；

14、s206、將步驟s205得到的上清液4使用濾膜過濾，得植物清液。

15、優(yōu)選地，步驟s1中，所述緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液pbs，所述緩沖溶液的ph值為7.2-7.4，所述球根植物組織的質(zhì)量與所述緩沖溶液的體積為1-4:4，單位為g:ml。

16、優(yōu)選地，步驟s1中，所述粉碎的溫度為3-5℃，所述粉碎的時間為2-5min，所述過濾為使用紗布過濾。

17、優(yōu)選地，步驟s2中所述處理包括以下步驟：

18、s201、將步驟s1得到的植物原液于4℃、1000g離心10min，得上清液1；

19、s202、將步驟s201得到的上清液1于4℃、3000g離心20min，得上清液2；

20、s203、將步驟s202得到的上清液2與半纖維素酶、果膠酶和纖維素酶混合，得酶混合液，室溫靜置消化2-3小時，于4℃、5000g離心120min，獲得上清液3；

21、s204、將步驟s203得到的上清液3依次使用0.8μm濾膜和0.45μm濾膜過濾，得濾液1；

22、s205、將步驟s204得到的濾液1于4℃、20000g離心90min，得上清液4；

23、s206、將步驟s205得到的上清液4使用0.22μm濾膜過濾，得植物清液；

24、其中，步驟s203中，所述半纖維素酶在所述酶混合液中的質(zhì)量濃度為0.1%-0.3%，所述果膠酶在所述酶混合液中的質(zhì)量濃度為0.05%-0.15%，所述纖維素酶在所述酶混合液中的質(zhì)量濃度為0.05%-0.15%。

25、更優(yōu)選地，步驟s203中，所述半纖維素酶在所述酶混合液中的質(zhì)量濃度為0.2%，所述果膠酶在所述酶混合液中的質(zhì)量濃度為0.1%，所述纖維素酶在所述酶混合液中的質(zhì)量濃度為0.1%。

26、優(yōu)選地，步驟s3中，將步驟s2得到的植物清液于4℃、120000g的條件下離心90min，保留沉淀，使用磷酸鹽緩沖溶液pbs重懸沉淀，重復(fù)1-2次，得重懸液。

27、更優(yōu)選地，所述使用磷酸鹽緩沖溶液pbs重懸沉淀為：向沉淀中加入磷酸鹽緩沖溶液pbs，吹打重懸，然后分次添加磷酸鹽緩沖溶液pbs，混合稀釋。

28、再優(yōu)選地，且作為本發(fā)明的一個實例，所述使用磷酸鹽緩沖溶液pbs重懸沉淀為：向沉淀中加入磷酸鹽緩沖溶液pbs，吹打重懸，然后分兩次添加磷酸鹽緩沖溶液pbs，每次添加磷酸鹽緩沖溶液pbs之后都進行吹打以混合稀釋。

29、優(yōu)選地，步驟s4中，所述過濾為使用0.22μm的濾膜進行過濾，所述濾液濃縮為使用100kda的超濾管于4℃、3000g離心濃縮。

30、優(yōu)選地，步驟s4中，所述濾液濃縮的比例為：每200g新鮮植物組織濃縮為0.2-0.8ml的濃縮液；更優(yōu)選地，每200g新鮮植物組織濃縮為0.5ml的濃縮液。

31、優(yōu)選地，步驟s4中，所述濾液濃縮之后，還包括柱色譜提取，所述柱色譜提取包括以下步驟：

32、將所述濾液濃縮后得到的濃縮液加入色譜柱中；在加入濃縮液后，加入3.5-4.5倍所述濃縮液的體積的磷酸鹽緩沖溶液pbs，收集流出液體，再加入5-6倍所述濃縮液的體積的磷酸鹽緩沖溶液pbs，收集流出液體并合并，即得球根植物細胞外囊泡。

33、更優(yōu)選地，所述柱色譜提取為使用izon?qev超純色譜柱對濃縮后的濃縮液進行柱色譜提取，所述柱色譜提取中：

34、在加入濃縮液后，加入4倍所述濃縮液的體積的磷酸鹽緩沖溶液pbs，收集流出液體，再加入5.6倍所述濃縮液的體積的磷酸鹽緩沖溶液pbs，收集流出液體并合并，濃縮，即得球根植物外泌體。

35、另一方面，本發(fā)明提供了上述制備方法制得的球根植物細胞外囊泡。

36、再一方面，本發(fā)明提供了上述制備方法在生產(chǎn)植物細胞外囊泡中的應(yīng)用。

37、優(yōu)選地，所述植物細胞外囊泡為球根植物細胞外囊泡。

38、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

39、（1）本發(fā)明將酶解融入多種細胞外囊泡細胞外囊泡提取方法中，得到了制備球根植物來源細胞外囊泡的優(yōu)選方法，解決了球根植物地下貯藏器官因淀粉含量高、破壁難以獲得汁液或汁液過于粘稠而難以獲得細胞外囊泡的困境。且本發(fā)明同樣適用于風(fēng)干植物組織，可應(yīng)用于需炮制減毒的植物藥材。

40、（2）采用本發(fā)明植物細胞外囊泡的提取方法提取球根植物細胞外囊泡，提取過程使用的試劑種類少且易獲取、儀器類型單一，無需大量的細胞培養(yǎng)液即可獲得尺寸在160nm左右的百合細胞外囊泡和尺寸在150nm左右的石蒜細胞外囊泡。

41、（3）本發(fā)明獲得的細胞外囊泡純度、產(chǎn)率均較高，百合細胞外囊泡純度可達6.05×1011particles/μg，石蒜細胞外囊泡純度可達2.18×1011particles/μg。