本發(fā)明涉及微生物，具體涉及一株重組番鴨細小病毒、疫苗、卵黃抗體及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、細小病毒屬(parvovirus)的病毒粒子無囊膜，對外界的抵抗力較強，對酒精、乙醚、氯仿有抵抗性，對溫度也有一定耐受性。水禽細小病毒病屬于細小病毒屬，是一種急性、高傳染性疾病，可引起水禽較高的發(fā)病率和病死率，給水禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失。水禽細小病毒分為鵝細小病毒(goose?parvovirus，gpv)相關(guān)類群和番鴨細小病毒(muscovyduck?parvovirus，mdpv)相關(guān)類群。重組番鴨細小病毒(recombinant?muscovy?duckparvovirus，r-mdpv)由番鴨細小病毒(muscovy?duck?parvovirus，mdpv)和鵝細小病毒(goose?parvovirus，gpv)基因重組而來，屬于細小病毒亞科依賴病毒屬，是一種單鏈?dna病毒，病毒粒子為球形，呈正二十面體對稱結(jié)構(gòu)。

2、在感染特性方面，鵝細小病毒和番鴨細小病毒均可感染番鴨發(fā)病，而番鴨細小病毒卻不能感染鵝群發(fā)??；一般認為，由番鴨細小病毒(mdpv)和鵝細小病毒(gpv)重組而成的重組番鴨細小病毒(r-mdpv)也主要感染雛番鴨，對鵝或者其他雁形目鳥科均沒有感染性。在防治方面，雖然重組番鴨細小病毒是由番鴨細小病毒(mdpv)和鵝細小病毒(gpv)重組而成，但無法通過分別注射兩種疫苗（mdpv疫苗，gpv疫苗）獲取綜合效果來防治重組番鴨細小病毒。因為重組番鴨細小病毒重組位點復(fù)雜，其衣殼蛋白所能結(jié)合的抗體不是簡單的gpv或者mdpv混合就可以，而是需要全新的衣殼蛋白刺激產(chǎn)生的抗體才能夠有效果，即使以經(jīng)典型mdpv弱毒疫苗株免疫過的雛番鴨對rmdpv仍舊易感染，防治難度大。因此，必須針對性地開發(fā)可以防治由特定重組番鴨細小病毒所引起疾病的產(chǎn)品。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一株重組番鴨細小病毒、疫苗、卵黃抗體及應(yīng)用。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的第一方面，提供一株重組番鴨細小病毒，所述的重組番鴨細小病毒為重組番鴨細小病毒( anas?platyrhynchos?recombinatus?parvovirus)?rmdpv-gd23，已于2024年10月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），保藏編號為cgmcc?no.46206。

4、該重組番鴨細小病毒可感染雛番鴨，感染番鴨出現(xiàn)腸粘膜脫落形成腸栓的特征性病變，具有明顯“脫羽”癥狀；感染雛鵝在14日齡左右會出現(xiàn)脖頸部羽毛的脫落，在4周齡的時候在背部會有少量羽毛脫落現(xiàn)象，該病毒會嚴(yán)重影響鵝的整體羽絨質(zhì)量，患病鵝的羽毛質(zhì)量差，手感殘次不齊，同時可產(chǎn)羽絨量大幅降低。

5、與其他重組番鴨細小病毒相比，本發(fā)明的重組番鴨細小病毒rmdpv-gd23具有跨種傳播能力。

6、同源重組分析發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的重組番鴨細小病毒rmdpv-gd23在p9啟動子區(qū)域和vp結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域各重組了一段。

7、本發(fā)明的第二方面，提供所述的重組番鴨細小病毒在制備防治由重組番鴨細小病毒引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

8、進一步的，所述的產(chǎn)品包括活疫苗、亞單位疫苗、重組基因疫苗、核酸疫苗和滅活疫苗。

9、本技術(shù)的疫苗可劑型化為全身或局部給藥用藥劑，可以包含藥學(xué)上可接受的載體，例如磷酸緩沖用食鹽水溶液、蒸餾水、水/乳乳劑、潤濕劑、乳化劑、?ph調(diào)節(jié)劑等。

10、在一些實施方式中，滅活疫苗的制備方法包括如下步驟：

11、?(1)油相制備：取獸用白油94份，硬脂酸鋁2?份，置于油相制備罐中加熱至80℃后，再加span-80?6份，至溫度達到115℃時，維持30min，冷卻后備用。

12、(2)水相制備：將滅活后檢驗合格的病毒液96份加入4份滅菌tween-80，開動勻漿機攪拌20~30min，使tween-80完全溶解。

13、(3)乳化：油相與水相體積比為2:1，先將油相導(dǎo)入膠體磨，2500?轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，緩慢加入水相，加完后10000轉(zhuǎn)/分鐘乳化5分鐘。在終止乳化前按疫苗總量0.01%加入硫柳汞，充分振蕩混勻。乳化后，取10ml，以3000r/min離心15分鐘，管底無水相析出。獲得滅活疫苗，對滅活疫苗無菌分裝后，軋蓋貯存于2~8℃。

14、本發(fā)明的第三方面，提供一種重組番鴨細小病毒疫苗，所述的重組番鴨細小病毒疫苗包括所述的重組番鴨細小病毒。

15、進一步的，還包括佐劑。

16、所述的佐劑包括鋁佐劑、油乳佐劑、微生物類佐劑、蜂膠佐劑、左旋咪唑佐劑、脂質(zhì)體佐劑、中藥佐劑及小肽類佐劑。在一些實施方式中，所述的佐劑為白油。

17、本發(fā)明的第四方面，提供所述的重組番鴨細小病毒疫苗在制備防治由重組番鴨細小病毒引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

18、本發(fā)明的第五方面，提供一種重組番鴨細小病毒疫苗組合物，包括所述的重組番鴨細小病毒疫苗。

19、所述的重組番鴨細小病毒疫苗組合物中，重組番鴨細小病毒疫苗還可以和鵝細小病毒疫苗或番鴨細小病毒疫苗或其他重組番鴨細小病毒疫苗中的至少一種聯(lián)用。

20、本發(fā)明的第六方面，提供一種卵黃抗體，所述的卵黃抗體是用所述的重組番鴨細小病毒疫苗作為抗原制備而成。

21、在一些實施方式中，制備的方法包括如下步驟：

22、(1)?蛋殼消毒：收集高免雞蛋在1%新潔爾滅溶液中浸泡15min。取出晾干后，對蛋殼表面噴灑75%的酒精消毒，備用。

23、(2)?卵黃分離：采取機械打蛋方式，打蛋時應(yīng)充分除去蛋清、胚盤和系帶，收集卵黃。

24、(3)?滅活?。簩⑹占牡包S充分攪拌，使蛋黃呈均勻膏狀，啟動蠕動泵，將蛋黃液泵入夾層反應(yīng)罐中，加入與蛋黃等體積的注射用水(注射用水先經(jīng)80℃?30min消毒，并冷卻至65℃以下)，攪拌混勻后，60~65℃保溫(滅活)30min。

25、(4)?酸化萃提：先在隔離反應(yīng)罐中加入相當(dāng)于原蛋黃3倍體積的ph值5.0的醋酸緩沖液，然后加入卵黃液，開啟攪拌機，充分拌攪30分鐘。

26、(5)?滅活ⅱ：卵黃液液中加入終濃度(v/v)為4%的辛酸作滅活劑和萃提劑，劇烈攪拌90min，2~8℃放置4~8小時。

27、(6)?粗濾：用丙綸750b濾布過濾后，再用柱芯濾器過濾至澄清。

28、(7)?除菌過濾：用0.22μm濾膜過濾除菌。置2~8℃存放，應(yīng)不超過14?日。同時取樣檢測番鴨細小病毒的中和抗體效價。

29、(8)?濃縮：如檢測的番鴨細小病毒的中和抗體效價低于1:512，應(yīng)將除菌過濾后的卵黃抗體在2~8℃條件下，用30~50kd的濃縮膜包進行適當(dāng)倍數(shù)的超濾濃縮，濃縮后的番鴨細小病毒中和抗體效價應(yīng)均不低于1:512。

30、(9)?滅活ⅲ：將濃縮后的溶液導(dǎo)入滅活罐中，計量加入10%的甲醛溶液，開啟攪拌機攪拌，使其充分混合，甲醛溶液的最終濃度(v/v)為0.1%，37℃滅活16小時。

31、(10)?分裝貯存：滅活好的濾液的中和抗體效價不低于1：512，在無菌條件下將該濾液分裝于無菌玻璃瓶中，蓋好膠塞，軋鋁蓋，貼上標(biāo)簽，保存?zhèn)溆?，保存溫度?20℃。

32、本發(fā)明的第七方面，提供所述的卵黃抗體在制備防治由重組番鴨細小病毒引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

33、本發(fā)明的第八方面，提供一種防治重組番鴨細小病毒病的產(chǎn)品，所述的產(chǎn)品包含有藥理有效濃度的所述的卵黃抗體。

34、本發(fā)明的有益效果：

35、(1)本發(fā)明從發(fā)病番鴨體內(nèi)分離得到一株重組番鴨細小病毒rmdpv-gd23，該毒株能夠?qū)е码r番鴨生長發(fā)育受阻，同時病毒能夠?qū)崿F(xiàn)跨種感染，對鵝造成生長發(fā)育遲緩及“脫羽”現(xiàn)象。對rmdpv-gd23進行全基因組分析，將該毒株命名為rmdpv-gd23，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmcc?no.46206。

36、?(2)本發(fā)明進一步利用該毒株rmdpv-gd23制備滅活疫苗。經(jīng)過檢驗，本發(fā)明制備的滅活疫苗的劑型為油包水型(w/o)；離心穩(wěn)定性、粘度和無菌檢查符合《中華人民共和國獸藥典》(2020版)的規(guī)定。進一步對該疫苗進行檢驗：安全性檢驗結(jié)果證明試制疫苗安全無害，對動物生長無影響；保護性檢驗結(jié)果顯示，該滅活疫苗的免疫保護率能達到80%。綜上，本發(fā)明制備的番鴨源重組番鴨細小病毒rmdpv-gd23滅活疫苗是一種免疫效果比較理想的滅活疫苗，能夠有效的預(yù)防鵝發(fā)育遲緩及以“脫羽”為病變特征的由重組番鴨細小病毒引起的疾病的發(fā)生。

37、(3)?本發(fā)明進一步利用該滅活疫苗制備重組番鴨細小病毒卵黃抗體，對卵黃抗體進行質(zhì)量檢驗，結(jié)果證實該卵黃抗體通過了安全性檢驗、無菌檢驗和效力檢驗(免疫攻毒法)。將該卵黃抗體用于由重組番鴨細小病毒引起的疾病的預(yù)防和治療，對番鴨和雛鵝均具有效果。本發(fā)明對于目前流行的可造成“脫羽”癥狀且可跨種傳播的高死亡率的由重組番鴨細小病毒引起的疾病具有防治作用，改變了目前尚無疫苗可以進行預(yù)防、常規(guī)的抗病毒和抗菌治療方法收效甚微的局面。