本發(fā)明涉及生物酶催化劑，尤其涉及一種用于制備貽貝粘蛋白的生物酶催化劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
1、貽貝粘蛋白是一種具有高強(qiáng)度、高韌性和良好防水性的天然生物粘合劑，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、海洋工程、表面化學(xué)及日化用品等多個(gè)領(lǐng)域。貽貝粘蛋白在濕環(huán)境中表現(xiàn)出的超強(qiáng)界面粘附能力依賴于其自身復(fù)雜的固化調(diào)控過(guò)程，包括腺細(xì)胞內(nèi)由酪氨酸酶催化的粘膠蛋白翻譯后修飾反應(yīng)、反應(yīng)結(jié)束后的蛋白質(zhì)儲(chǔ)存、在囊泡中成熟蛋白的多巴（3,4-二羥基苯丙氨酸）的抗氧化保護(hù)、蛋白分泌后在粘附界面的延遲氧化以及水環(huán)境中ph轉(zhuǎn)變等。傳統(tǒng)的貽貝粘蛋白提取方法主要依賴于從貽貝足絲中提取，但這種方法受到原材料及提取工藝的限制，效率及產(chǎn)量較低，難以滿足大規(guī)模應(yīng)用的需求。因此，近年來(lái)多采用基因工程技術(shù)和生物酶催化手段進(jìn)行重組貽貝粘蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)。
2、現(xiàn)有技術(shù)中，酪氨酸酶是一種常用的生物酶催化劑，可以將蛋白序列中的酪氨酸氧化成多巴，進(jìn)一步形成膜或是網(wǎng)狀支架，促使蛋白質(zhì)更加緊密、穩(wěn)固地附著在人體表面。專利公開(kāi)號(hào)為cn117247441a的發(fā)明專利，公開(kāi)了一種重組貽貝粘蛋白及其表達(dá)體系和應(yīng)用，通過(guò)將重組貽貝粘蛋白與酪氨酸酶混合，得到具備美白、抗氧化、促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)以及促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)多項(xiàng)功能的重組貽貝粘蛋白。但酪氨酸酶的活性受ph值和溫度的影響。酪氨酸酶通常在近中性的水溶液中表現(xiàn)出最高催化活性，且對(duì)溫度變化敏感。一旦環(huán)境條件超出其最適范圍，酶活性將顯著下降甚至喪失，進(jìn)而影響重組貽貝粘蛋白的產(chǎn)率和質(zhì)量。此外，在高濃度底物或產(chǎn)物存在下，酪氨酸酶的活性也容易受到抑制。底物抑制可以通過(guò)連續(xù)滴加法控制低水平的底物濃度來(lái)緩解，但產(chǎn)物抑制則比較難以解決，從而影響重組貽貝粘蛋白的最終功能特性。同時(shí)在水溶液中穩(wěn)定性較高，但在非水介質(zhì)中活性會(huì)顯著降低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了解決上述背景技術(shù)中提到的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種用于制備貽貝粘蛋白的生物酶催化劑及其制備方法。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
3、一種用于制備貽貝粘蛋白的生物酶催化劑的制備方法，包括以下步驟：
4、s1、將n-異丙基丙烯酰胺和乙烯基咪唑加入預(yù)先裝有溶劑二甲基甲酰胺的反應(yīng)器中，攪拌至完全溶解，形成透明溶液，置于油浴中預(yù)熱，通氮?dú)獬?5-25min，確保反應(yīng)體系無(wú)氧，迅速加入偶氮二異丁腈，繼續(xù)通氮?dú)?-15min，密封反應(yīng)器，保溫?cái)嚢?，反?yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，得到共聚物溶液，將共聚物溶液倒入乙醇中，攪拌30-60min后靜置2-3h，形成沉淀，過(guò)濾收集沉淀物，用乙醇洗滌3-5次，在40-50℃下真空干燥至恒重，得到聚n-異丙基丙烯酰胺-聚乙烯基咪唑共聚物；
5、s2、將甲殼素粉末加入酸溶液（1-2%hcl溶液）中，攪拌2-4h，過(guò)濾去除不溶物，收集濾液，將濾液加入堿溶液（1-2%naoh溶液）中，調(diào)節(jié)ph值至中性，再次過(guò)濾收集沉淀，用去離子水洗滌沉淀至中性，60-70℃下真空干燥至恒重，得到甲殼素，將甲殼素加入濃硫酸中，攪拌至甲殼素完全溶解，緩慢滴加發(fā)煙硫酸，保持反應(yīng)溫度，攪拌反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，將反應(yīng)液緩慢倒入冰水中，靜置2-8h形成沉淀，過(guò)濾收集沉淀物，用去離子水洗滌至中性，在60-70℃下干燥至恒重，得到改性甲殼素衍生物；
6、s3、將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶加入磷酸鹽緩沖液中，在室溫下輕輕攪拌30-40min，加入共聚物和改性甲殼素衍生物，調(diào)節(jié)反應(yīng)條件，在室溫下攪拌2-4h，靜置12-24h，離心或過(guò)濾分離，置于4℃冰箱中保存，得到生物酶催化劑。
7、進(jìn)一步地，步驟s1中油浴中預(yù)熱的溫度為70-80℃。
8、進(jìn)一步地，步驟s1中保溫的溫度為70-80℃，攪拌的速度為100-200rpm，反應(yīng)的時(shí)間為24-48h。
9、進(jìn)一步地，步驟s1中n-異丙基丙烯酰胺、乙烯基咪唑、二甲基甲酰胺和偶氮二異丁腈的質(zhì)量比為（5.1-5.4）：（5.5-5.9）：（18-20）：（0.1-0.3）。
10、進(jìn)一步地，步驟s2中甲殼素、濃硫酸和發(fā)煙硫酸的質(zhì)量比為（6-7）：（20-20.5）：（10.2-10.6）。
11、進(jìn)一步地，步驟s2中反應(yīng)的溫度為80-90℃，攪拌的速度為100-200rpm，反應(yīng)的時(shí)間為4-6h。
12、進(jìn)一步地，步驟s3中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、酪氨酸酶、共聚物、甲殼素衍生物和磷酸鹽緩沖液的質(zhì)量比為（0.1-0.2）：（0.05-0.1）：（1-1.5）：（1.8-2）：20。
13、進(jìn)一步地，步驟s3中調(diào)節(jié)反應(yīng)條件為：調(diào)節(jié)ph值為6.5-7.5，溫度為25-30℃，加入飽和nacl溶液調(diào)整離子強(qiáng)度至0.1-0.2m。
14、根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了上述制備方法制得的用于制備貽貝粘蛋白的生物酶催化劑。
15、本發(fā)明的有益效果：
16、1、本發(fā)明技術(shù)方案中，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶通過(guò)其活性中心與底物（共聚物和甲殼素衍生物）結(jié)合，形成酶-底物復(fù)合物，使底物能夠更好地接近酶的活性中心。聚n-異丙基丙烯酰胺-聚乙烯基咪唑共聚物具有獨(dú)特的溫度敏感性，能夠在特定溫度下發(fā)生相變，使得共聚物能夠在不同的溫度下對(duì)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶的活性產(chǎn)生精準(zhǔn)調(diào)控，通過(guò)改變酶的構(gòu)象或微環(huán)境，優(yōu)化催化條件，提高貽貝粘蛋白的制備效率。共聚物通過(guò)與酶的非共價(jià)鍵相互作用，有效穩(wěn)定了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶的構(gòu)象，防止了酶在催化過(guò)程中的失活。同時(shí)，共聚物還可能作為酶的輔助因子，直接參與催化過(guò)程，進(jìn)一步提升了酶的催化效率，加速了貽貝粘蛋白的合成。
17、2、本發(fā)明技術(shù)方案中，甲殼素衍生物憑借其特定的官能團(tuán)和結(jié)構(gòu)特性，不僅可能作為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和酪氨酸酶的底物直接參與催化反應(yīng)，還通過(guò)影響酶的活性中心結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)酶的催化活性。
18、3、催化反應(yīng)完成后，酶能夠迅速將生成的貽貝粘蛋白與底物分子分開(kāi)，恢復(fù)到原始狀態(tài)，準(zhǔn)備再次進(jìn)行反應(yīng)。共聚物和甲殼素衍生物在這一過(guò)程中起到穩(wěn)定酶構(gòu)象或促進(jìn)產(chǎn)物釋放的作用，確保了催化過(guò)程的連續(xù)性和高效性。
1.一種用于制備貽貝粘蛋白的生物酶催化劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于制備貽貝粘蛋白的生物酶催化劑的制備方法，其特征在于，步驟s1中油浴中預(yù)熱的溫度為70-80℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于制備貽貝粘蛋白的生物酶催化劑的制備方法，其特征在于，步驟s1中保溫的溫度為70-80℃，攪拌的速度為100-200rpm，反應(yīng)的時(shí)間為24-48h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于制備貽貝粘蛋白的生物酶催化劑的制備方法，其特征在于，步驟s1中n-異丙基丙烯酰胺、乙烯基咪唑、二甲基甲酰胺和偶氮二異丁腈的質(zhì)量比為（5.1-5.4）：（5.5-5.9）：（18-20）：（0.1-0.3）。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于制備貽貝粘蛋白的生物酶催化劑的制備方法，其特征在于，步驟s2中甲殼素、濃硫酸和發(fā)煙硫酸的質(zhì)量比為（6-7）：（20-20.5）：（10.2-10.6）。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于制備貽貝粘蛋白的生物酶催化劑的制備方法，其特征在于，步驟s2中反應(yīng)的溫度為80-90℃，攪拌的速度為100-200rpm，反應(yīng)的時(shí)間為4-6h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于制備貽貝粘蛋白的生物酶催化劑的制備方法，其特征在于，步驟s3中轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、酪氨酸酶、共聚物、甲殼素衍生物和磷酸鹽緩沖液的質(zhì)量比為（0.1-0.2）：（0.05-0.1）：（1-1.5）：（1.8-2）：20。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于制備貽貝粘蛋白的生物酶催化劑的制備方法，其特征在于，步驟s3中調(diào)節(jié)反應(yīng)條件為：調(diào)節(jié)ph值為6.5-7.5，溫度為25-30℃，加入飽和nacl溶液調(diào)整離子強(qiáng)度至0.1-0.2m。
9.一種如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的制備方法制得的用于制備貽貝粘蛋白的生物酶催化劑。