本技術(shù)涉及抗菌肽提取，更具體地說，它涉及一種海洋生物抗菌肽組分的提取工藝。

背景技術(shù)：

1、抗菌肽是一類分子量小于7000的多肽物質(zhì)，其具有獨(dú)特的廣譜抗菌性、抗腫瘤和抗病毒的能力。其中，昆蟲抗菌肽是昆蟲用以抵抗外界不利因素從而產(chǎn)生的免疫因子，具有分子量小，熱穩(wěn)定性高，抑菌性強(qiáng)，致病菌不產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，是一類良好的抗菌性物質(zhì)。

2、大黃魚是一種廣泛分布于沿岸及近海砂泥底質(zhì)水域的海水魚，其具有豐富的蛋白質(zhì)，是提取抗菌肽的優(yōu)選原料。

3、目前常用的抗菌肽提取方法包括酸法提取、堿法提取和生物酶法等提取工藝，得到粗提取物，再通過膜分離技術(shù)得到高純度的抗菌肽，其中生物酶法的反應(yīng)條件更加溫和且水解程度較高，對(duì)氨基酸破壞小，在多肽粗提取加工過程中已獲得廣泛應(yīng)用。但是生物蛋白酶價(jià)格昂貴，不僅耗費(fèi)大量蛋白酶，而且酶解時(shí)間長(zhǎng)，生產(chǎn)成本高，此外現(xiàn)有膜分離技術(shù)中常用的c18?固定相因其分離機(jī)理單一，無法很好的去除雜質(zhì)粒子，導(dǎo)致最終提純的抗菌肽的純度和收率降低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述背景技術(shù)中提及的問題，本技術(shù)提供了一種海洋生物抗菌肽組分的提取工藝。

2、一種海洋生物抗菌肽組分的提取工藝，包括以下步驟：

3、步驟s1、脫脂處理：將新鮮大黃魚去鱗、去內(nèi)臟后，剪碎，自來水清洗3-5次，脫脂處理，得脫脂魚肉；

4、步驟s2、粗提?。簩⒚撝~肉加入緩沖液中，剪切處理15-20min?并維持溫度為52-56℃，超濾離心，得蛋白粗提取液，其中，緩沖液和脫脂魚肉的質(zhì)量比為20-30：1；

5、步驟s3、電場(chǎng)改性：將羥基酪醇加入蛋白粗提取液中，再加入酸值調(diào)節(jié)液調(diào)節(jié)ph值至1-3，將酸調(diào)節(jié)后的蛋白粗提取液泵送至高壓脈沖電場(chǎng)處理室中進(jìn)行高壓脈沖電場(chǎng)處理，得到高壓脈沖電場(chǎng)改性液，其中，羥基酪醇和蛋白粗提取液的質(zhì)量比為0.06-0.1：25；

6、步驟s4、酶解：將ph調(diào)節(jié)劑加入高壓脈沖電場(chǎng)改性液中，攪拌均勻，再加入胰蛋白酶，控制在36-38℃下消化過夜，得酶解液，其中，ph調(diào)節(jié)劑、高壓脈沖電場(chǎng)改性液和胰蛋白酶的質(zhì)量比為0.07-0.08：20：6-8；

7、步驟s5、精提純：將功能化硅膠超聲分散于酶解液中，室溫下攪拌2-3h，過濾，得多肽吸附物，多肽吸附物經(jīng)解吸液洗滌，得多肽精提液，多肽精提液經(jīng)吸附-脫鹽和真空濃縮，得海洋生物抗菌肽組分，其中，功能化硅膠和酶解液的質(zhì)量比為2.2-2.4：1。

8、優(yōu)選的，所述步驟s1中，脫脂處理過程包括：將剪碎的脫脂魚肉放入10-20%(w/v)碳酸鈉溶液中處理8-10h，料液質(zhì)量比為1：20-30，溫度為4-6℃，用去離子水清洗至中性，然后放入20-30%(v/v)異丙醇溶液中處理12-16h，料液質(zhì)量比為1：20-40，溫度為4-6℃，用去離子水清洗3-5次。

9、優(yōu)選的，所述步驟s2中，緩沖液由去離子水、甘油、氯化鈉、二硫蘇糖醇和碳酸鈉按質(zhì)量比62-74：18-22：0.6-1.0：0.04-0.06：2-4混合而成。

10、優(yōu)選的，所述步驟s2中，超濾膜的截留分子量為5kda。

11、優(yōu)選的，所述步驟s3中，高壓脈沖電場(chǎng)處理中設(shè)置流速為6-8ml/min，電場(chǎng)強(qiáng)度為15-18kv/cm，脈沖數(shù)為8。

12、優(yōu)選的，所述步驟s4中，ph調(diào)節(jié)劑為0.05-0.07m的碳酸銨水溶液。

13、優(yōu)選的，所述步驟s5中，所述吸附-脫鹽是將多肽精提液經(jīng)150da的超濾膜過濾，解吸液為ph?7.6-8.2的磷酸氫二鈉水溶液。

14、優(yōu)選的，所述功能化硅膠的制備方法，包括以下步驟：

15、步驟a1、將硅膠加入鹽酸溶液中，升溫至35-45℃，攪拌8-10h，洗滌至中性，真空干燥，得酸化硅膠；將酸化硅膠超聲分散于無水甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，邊攪拌邊加入三乙胺和3-氯丙基三甲氧基硅烷，升溫至回流，攪拌反應(yīng)18-24h，洗滌，干燥，得氯取代硅膠，其中，硅膠和鹽酸溶液的質(zhì)量比為30-40：220-260，鹽酸溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20-30%，酸化硅膠、無水甲苯、三乙胺和3-氯丙基三甲氧基硅烷的質(zhì)量比為12-16：52-56：0.24-0.32：14-20，在上述反應(yīng)過程中，以三乙胺為催化劑，酸化硅膠與3-氯丙基三甲氧基硅烷發(fā)生縮合反應(yīng)，得氯取代硅膠；

16、步驟a2、將氯取代硅膠超聲分散于無水甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，再加入4-三氟甲基鄰苯二胺，升溫至回流，攪拌反應(yīng)42-48h，反應(yīng)結(jié)束后，洗滌，干燥，得苯基硅膠，其中，氯取代硅膠、無水甲苯和4-三氟甲基鄰苯二胺的質(zhì)量比為12-14：55-65：8.4-11.2，在上述反應(yīng)過程中，氯取代硅膠上的活性氯原子和4-三氟甲基鄰苯二胺上的氮原子發(fā)生親核取代反應(yīng)，得苯基硅膠；

17、步驟a3、將苯基硅膠超聲分散于無水二氯甲烷中，調(diào)節(jié)ph至9-10，邊攪拌邊滴加十八烯基琥珀酸酐和無水二氯甲烷的混合液a，控制在30min內(nèi)滴完，滴畢，升溫至74-80℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)6-10h，調(diào)節(jié)ph至中性，旋蒸，洗滌，干燥，得羧基化硅膠，其中，苯基硅膠、無水二氯甲烷和混合液a的質(zhì)量比為4-6：22-26：10，混合液a中，十八烯基琥珀酸酐和無水二氯甲烷的質(zhì)量比為0.8-1.2：10，在上述反應(yīng)過程中，在堿性條件下，苯基硅膠上的氨基與十八烯基琥珀酸酐發(fā)生開環(huán)酯化反應(yīng)，得羧基化硅膠；

18、步驟a4、氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將羧基化硅膠、羥丙基封端聚硅氧烷和對(duì)甲苯磺酸加入無水甲苯中，攪拌均勻，升溫至82-86℃，攪拌反應(yīng)1-2h，反應(yīng)結(jié)束后，旋蒸，洗滌，干燥，得功能化硅膠，其中，羧基化硅膠、羥丙基封端聚硅氧烷、對(duì)甲苯磺酸和無水甲苯的質(zhì)量比為3-4：1.4-1.8：0.04-0.05：50-60，在上述反應(yīng)過程中，以無水甲苯為溶劑，對(duì)甲苯磺酸為催化劑，羧基化硅膠和羥丙基封端聚硅氧烷發(fā)生酯化反應(yīng)，得功能化硅膠。

19、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

20、（1）本發(fā)明技術(shù)方案中，在粗提取過程中加入了緩沖液，緩沖液中含有甘油，氯化鈉和二硫蘇糖醇，甘油可以降低溶液的極性，從而防止蛋白質(zhì)疏水聚集，提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，氯化鈉可以增加蛋白質(zhì)分子表面的電荷，進(jìn)而增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子與水分子之間的相互作用，使蛋白質(zhì)的溶解度增大，dtt可以裂解蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵，使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得更加松散，從而增加其在水溶液中的溶解度，同時(shí)配合剪切輔助熱處理，適度的外力和熱處理提供的熱量相結(jié)合，在不破壞魚肉蛋白結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上提高了魚肉蛋白的提取效率，使得后續(xù)制得的抗菌肽組分具有更高的生物活性。

21、（2）本發(fā)明技術(shù)方案中，在電場(chǎng)改性過程中加入了酸值調(diào)節(jié)液和羥基酪醇，酸值調(diào)節(jié)液不僅能夠降低dtt的活性，防止dtt可能破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，而且它還能促進(jìn)羥基酪醇和dtt間的化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而去除過量的dtt，同時(shí)配合高壓脈沖電場(chǎng)處理，使得魚肉蛋白分子間氫鍵相互作用被破壞，結(jié)構(gòu)展開，蛋白質(zhì)聚集體解聚均勻分散在溶液中，更多的酶作用位點(diǎn)被暴露，增加了酶的利用率，同時(shí)提高了酶解速率。

22、（3）本發(fā)明技術(shù)方案中，為了提高抗菌肽組分的提取率，同時(shí)降低脫鹽性能，本技術(shù)在精提純過程中，先采用功能化硅膠對(duì)酶解液中的多肽組分進(jìn)行吸附，再經(jīng)解吸液洗滌，最后，再經(jīng)脫鹽，得到抗菌肽組分，功能化硅膠中含有柔性長(zhǎng)鏈烷烴、苯環(huán)和三氟甲基，柔性長(zhǎng)鏈烷烴具有疏水性，能夠與多肽鏈上的長(zhǎng)鏈分子發(fā)生糾纏繞結(jié)，提高抗菌肽組分的提取率，苯環(huán)和低極性三氟甲基的存在，降低了制備得到的功能化硅膠的極性，進(jìn)一步提高了抗菌肽組分的提取率。