本發(fā)明屬于分離純化，具體涉及一種3-巖藻糖基乳糖的分離純化方法。

背景技術(shù)：

1、母乳寡糖（human?milk?oligosaccharides，hmos）是母乳中重要的生物活性成分，被認(rèn)為對(duì)嬰兒健康有益，近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注。據(jù)報(bào)道，母乳中含有約35~60%的含巖藻糖基的寡糖對(duì)嬰兒和成人都有極大的益處。特別是2’-巖藻糖基乳糖（2’-fl）和3-巖藻糖基乳糖（3-fl），他們是由l-巖藻糖和d-乳糖組成的兩種同型異構(gòu)的三糖，是巖藻糖基hmos的兩個(gè)主要組成部分。在2’-fl中，l-巖藻糖與乳糖中半乳糖的c-2單元相連，而在3-fl中，l-巖藻糖與乳糖中葡萄糖的c-3單元相連，因此兩者有眾多相似的化學(xué)性質(zhì)，但物理性質(zhì)和生物特性卻有很多不同。3-fl作為含量第二多的巖藻糖基hmos，一些研究證實(shí)了其不僅可以有效地保護(hù)宿主免受某些病毒或細(xì)菌侵染，而且可以作為益生元選擇性地促進(jìn)有益微生物和抑制有害微生物的生長(zhǎng)，從而建立健康的腸道微生物群環(huán)境，且這一作用是特異性的，2’-fl或其他hmos不具備相應(yīng)性能。因此，3-fl作為一種營(yíng)養(yǎng)保健食品配料備受關(guān)注。但是，3-fl是一種天然存在的糖類物質(zhì)，其在母乳中的含量相對(duì)較低，在牛乳中也不存在，這在一定程度上限制了3-fl的開發(fā)和應(yīng)用。

2、近年來(lái)，隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的相關(guān)技術(shù)表明可以通過對(duì)不同的底盤菌株加以改造，如大腸桿菌、釀酒酵母等，生產(chǎn)出高滴度的3-fl，從而為人工合成廉價(jià)的3-fl奠定了基礎(chǔ)。目前3-fl的最高產(chǎn)量不超過50?g/l，這個(gè)產(chǎn)量相對(duì)于更加成熟的2’-fl（大于120?g/l）的生物合成來(lái)說(shuō)，仍然處于較低水平。由于在合成生物學(xué)的合成體系中，發(fā)酵液中培養(yǎng)基的原始組分差異是較小的，即雜質(zhì)的濃度是一定的，而產(chǎn)物的濃度越高，則最初的發(fā)酵液中產(chǎn)物和雜質(zhì)的比值越大，有利于大幅簡(jiǎn)化傳統(tǒng)的下游純化工藝并縮減純化成本，或者在相同工藝下，得到更高品質(zhì)的產(chǎn)物。而目前3-fl的最高產(chǎn)量仍處于較低水平，這導(dǎo)致了3-fl的下游純化手段更加困難。

3、目前，寡糖的提取純化工藝常用的是硅膠層析、離子交換層析、大孔樹脂非特異性吸附或者模擬流化床等，基本都要用到層析色譜工藝，層析工藝較低的載藥量眾所周知，一旦大規(guī)模生產(chǎn)將必然涉及到使用大量的填料來(lái)填充層析柱，再加層析填料使用后需要再生，大量的酸堿液或有機(jī)溶劑也將是大額開銷，導(dǎo)致純化成本高昂，且環(huán)境污染嚴(yán)重。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種3-巖藻糖基乳糖的分離純化方法，本發(fā)明提供的方法不僅能夠得到高純度的3-巖藻糖基乳糖的結(jié)晶產(chǎn)物，且3-巖藻糖基乳糖的結(jié)晶產(chǎn)物安全可靠；同時(shí)分離純化方法的成本顯著降低，綠色環(huán)保且低污染，適宜工業(yè)化應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種3-巖藻糖基乳糖的分離純化方法，包括以下步驟：

4、將所述結(jié)晶原液進(jìn)行一次結(jié)晶，得到一次結(jié)晶產(chǎn)物，所述結(jié)晶原液中3-巖藻糖基乳糖的質(zhì)量濃度≥500?g/l；將所述一次結(jié)晶產(chǎn)物溶解于水中，得到一次結(jié)晶產(chǎn)物溶液，將所述一次結(jié)晶產(chǎn)物溶液進(jìn)行重結(jié)晶，得到3-巖藻糖基乳糖結(jié)晶產(chǎn)物；

5、所述一次結(jié)晶或重結(jié)晶包括以下步驟：

6、將所述結(jié)晶原液或一次結(jié)晶產(chǎn)物溶液進(jìn)行第一濃縮，得到第一濃縮液，所述第一濃縮液的白利度為65~75%；

7、將所述第一濃縮液和第一晶種進(jìn)行第一混合，得到第一混合溶液；

8、將所述第一混合溶液進(jìn)行第二濃縮，得到第二濃縮液，所述第二濃縮液的白利度為78~83%；

9、將所述第二濃縮液和第二晶種進(jìn)行第二混合，得到第二混合溶液；

10、將所述第二混合溶液降溫結(jié)晶，所述降溫結(jié)晶的初始溫度為70~75℃，所述降溫結(jié)晶的終點(diǎn)溫度為50~60℃，由所述初始溫度降溫至所述終點(diǎn)溫度的過程中，至少接近所述終點(diǎn)溫度的時(shí)間區(qū)間內(nèi)的降溫速度≤4℃/h。

11、優(yōu)選的，所述結(jié)晶原液由生產(chǎn)原料液進(jìn)行前處理得到；所述生產(chǎn)原料液包括發(fā)酵液、酶法生產(chǎn)液、化學(xué)合成生產(chǎn)液和天然乳汁中的一種或多種；所述前處理包括依次進(jìn)行除鹽、脫色和濃縮；

12、所述結(jié)晶原液中3-巖藻糖基乳糖的質(zhì)量濃度為500~550?g/l。

13、優(yōu)選的，所述降溫結(jié)晶在攪拌的條件下進(jìn)行，所述攪拌的轉(zhuǎn)速為10~20?rpm；

14、所述降溫結(jié)晶包括依次進(jìn)行第一階段降溫結(jié)晶和第二階段降溫結(jié)晶，所述第一階段降溫結(jié)晶的終點(diǎn)溫度為63~67℃，所述第一階段降溫結(jié)晶的降溫速率為5~9℃/h，所述第二階段降溫結(jié)晶的降溫速率為1.75~3.75℃/h。

15、優(yōu)選的，所述降溫結(jié)晶結(jié)束后，還包括：在所述降溫結(jié)晶的終點(diǎn)溫度條件下進(jìn)行保溫結(jié)晶，所述保溫結(jié)晶的時(shí)間為18~24h。

16、優(yōu)選的，所述降溫結(jié)晶還包括：在所述第一階段降溫結(jié)晶的終點(diǎn)溫度進(jìn)行保溫處理，所述保溫處理的時(shí)間為1~2h。

17、優(yōu)選的，所述第一晶種的質(zhì)量占所述第一濃縮液體積的百分比為0.1~1w/v%；

18、所述第二晶種的質(zhì)量占所述第二濃縮液體積的百分比為0.1~1w/v%。

19、優(yōu)選的，所述第一濃縮、所述第一混合、所述第二濃縮的溫度獨(dú)立地為60~70℃；

20、所述第二混合的溫度為70~75℃。

21、優(yōu)選的，所述第一混合在攪拌的條件下進(jìn)行，所述第一混合攪拌的轉(zhuǎn)速為15~30rpm；所述第一混合包括以下步驟：在第一混合的溫度條件下，將所述第一晶種加入所述第一濃縮液中，然后進(jìn)行保溫?cái)嚢杌旌?，得到所述第一混合溶液；所述保溫?cái)嚢杌旌系臅r(shí)間為0.5~1h。

22、優(yōu)選的，所述第二混合在攪拌的條件下進(jìn)行，所述第二混合攪拌的轉(zhuǎn)速為10~20rpm；所述第二混合包括以下步驟：將所述第二濃縮液由第二濃縮的溫度升溫至第二混合的溫度，然后進(jìn)行保溫處理，保溫處理后再將所述第二晶種加入所述第二濃縮液中，得到第二混合溶液；所述保溫處理的時(shí)間為1~2h。

23、優(yōu)選的，所述一次結(jié)晶直接得到一次結(jié)晶漿料，還包括：將所述一次結(jié)晶漿料固液分離，得到一次結(jié)晶固相產(chǎn)物；將所述一次結(jié)晶固相產(chǎn)物進(jìn)行第一洗晶，得到所述一次結(jié)晶產(chǎn)物；

24、所述重結(jié)晶直接得到重結(jié)晶漿料，還包括：將所述重結(jié)晶漿料固液分離，得到重結(jié)晶固相產(chǎn)物；將所述重結(jié)晶固相產(chǎn)物進(jìn)行第二洗晶，得到所述3-巖藻糖基乳糖結(jié)晶產(chǎn)物；

25、所述第一洗晶或第二洗晶使用的試劑為乙醇水溶液。

26、本發(fā)明提供了一種3-巖藻糖基乳糖的分離純化方法，包括以下步驟：將所述結(jié)晶原液進(jìn)行一次結(jié)晶，得到一次結(jié)晶產(chǎn)物，所述結(jié)晶原液中3-巖藻糖基乳糖的質(zhì)量濃度≥500g/l；將所述一次結(jié)晶產(chǎn)物溶解于水中，得到一次結(jié)晶產(chǎn)物溶液，將所述一次結(jié)晶產(chǎn)物溶液進(jìn)行重結(jié)晶，得到3-巖藻糖基乳糖結(jié)晶產(chǎn)物；所述一次結(jié)晶或重結(jié)晶包括以下步驟：將所述結(jié)晶原液或一次結(jié)晶產(chǎn)物溶液進(jìn)行第一濃縮，得到第一濃縮液，所述第一濃縮液的白利度為65~75%；將所述第一濃縮液和第一晶種進(jìn)行第一混合，得到第一混合溶液；將所述第一混合溶液進(jìn)行第二濃縮，得到第二濃縮液，所述第二濃縮液的白利度為78~83%；將所述第二濃縮液和第二晶種進(jìn)行第二混合，得到第二混合溶液；將所述第二混合溶液降溫結(jié)晶，所述降溫結(jié)晶的初始溫度為70~75℃，所述降溫結(jié)晶的終點(diǎn)溫度為50~60℃，由所述初始溫度降溫至所述終點(diǎn)溫度的過程中，至少接近所述終點(diǎn)溫度的時(shí)間區(qū)間內(nèi)的降溫速度≤4℃/h。由于3-fl獨(dú)特的理化性質(zhì)，相對(duì)其同分異構(gòu)體2’-fl具有更強(qiáng)的極性和在水中更大的溶解度，因此3-fl在較低溫度或者較高濃度時(shí)會(huì)表現(xiàn)出極高的黏度，宏觀上糖液黏度越大則在微觀上越難形成大的晶體（成糊狀，過濾困難），且其過飽和溶液的介穩(wěn)區(qū)越大，因此3-fl的過飽和溶液需要在較高溫度且較低糖度下才有可能形成可以分離的較大晶體，但過高的溫度會(huì)使得過飽和溶液介穩(wěn)區(qū)變窄，從而迅速形成較多的微晶，使得本就不高的過飽和度急速下降，微晶難以生長(zhǎng)成可以分離的較大晶體。本發(fā)明通過控制：合適的起晶溫度（所述降溫結(jié)晶的初始溫度為70~75℃）、將起晶糖度和兩次添加晶種的時(shí)機(jī)進(jìn)行關(guān)聯(lián)（第一濃縮液的白利度為65~75%和第二濃縮液的白利度為78~83%）以及降溫結(jié)晶速率，能夠通過兩次結(jié)晶過程（即一次結(jié)晶和重結(jié)晶），實(shí)現(xiàn)對(duì)3-fl的高效分離純化，得到高品質(zhì)的3-fl結(jié)晶產(chǎn)物。由實(shí)施例的結(jié)果可知，本發(fā)明分離純化得到的3-fl結(jié)晶產(chǎn)物純度＞98%。

27、同時(shí)，本發(fā)明提供的分離純化方法相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)積極效果在于：

28、本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有方法簡(jiǎn)單易行，適配性極強(qiáng)。本發(fā)明專門針對(duì)3-fl的物理化學(xué)特性而設(shè)計(jì)的結(jié)晶分離純化方法，利用結(jié)晶來(lái)提取純化高品質(zhì)高純度3-fl產(chǎn)品，是最適配大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的工藝方法。本發(fā)明實(shí)施例證明本發(fā)明提供的結(jié)晶分離純化方法無(wú)論從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模還是到大生產(chǎn)，僅需按比例縮放體系即可，幾乎不需要做其他任何改變。

29、本發(fā)明更加經(jīng)濟(jì)實(shí)用，純化提取成本更低。本發(fā)明采用的結(jié)晶工藝僅需投資罐體和配套的冷卻加熱設(shè)備，無(wú)論固定投資還是單次成本都顯著低于色譜類工藝。

30、本發(fā)明更加綠色環(huán)保，污染低。傳統(tǒng)的層析色譜工藝必然要使用大量酸堿液來(lái)再生色譜填料，或者使用不同濃度的有機(jī)溶劑如乙醇等來(lái)洗脫物料，而這些在純化過程中制造的廢酸、廢堿和廢醇將會(huì)是很大的環(huán)保問題。本發(fā)明使用結(jié)晶分離純化方法作為主要的純化手段直接杜絕了酸堿和有機(jī)溶劑洗脫液的使用，綠色環(huán)保且低污染。

31、本發(fā)明生產(chǎn)的產(chǎn)品更加安全可靠。由于產(chǎn)品3-fl獨(dú)特的理化性質(zhì)，常規(guī)的冷卻結(jié)晶方法幾乎不能用于生產(chǎn)3-fl，而由于其過飽和溶液在低溫下具有高粘度，導(dǎo)致其過飽和溶液在低溫下也是穩(wěn)定的而不易成晶。相關(guān)技術(shù)常使用添加有機(jī)溶劑的方法，但3-fl產(chǎn)品常添加到嬰兒配方奶粉中作為功能因子或作為特醫(yī)食品使用，對(duì)其安全性要求極高。本發(fā)明在結(jié)晶過程中不使用任何有機(jī)溶劑或助晶劑，僅在洗滌時(shí)使用極少食品級(jí)乙醇，并且在后續(xù)干燥過程中也可以保證乙醇的完全揮發(fā)，非常安全可靠。