本發(fā)明涉及微藻育種，尤其是涉及外源滲透調(diào)節(jié)分子輔助微藻抗鹽脅迫適應(yīng)性進(jìn)化的方法。

背景技術(shù)：

1、微藻作為一類具有高效光合作用能力的微生物，其在食品、美妝和醫(yī)藥等多個(gè)行業(yè)的應(yīng)用價(jià)值日益凸顯。傳統(tǒng)微藻培養(yǎng)方法主要依賴于淡水資源，這不僅增加了培養(yǎng)成本，還可能受到水資源短缺和生物污染的困擾。利用海水配置培養(yǎng)基開展微藻培養(yǎng)可以顯著降低培養(yǎng)成本，并減少淡水資源的消耗。然而，海水中的高鹽度對(duì)微藻的生長(zhǎng)和代謝構(gòu)成了嚴(yán)重的脅迫，限制了其在海水環(huán)境中的直接應(yīng)用。因此，馴化螺旋藻、小球藻、雨生紅球藻等淡水新食品資源藻種以耐受更高的鹽度，對(duì)于推進(jìn)藻類產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

2、傳統(tǒng)的適應(yīng)性篩選方法，如自然選擇和逐步適應(yīng)法，雖然能夠在一定程度上提高微藻的耐鹽性，但往往周期長(zhǎng)、效率低，難以滿足快速選育新品種的需求。此外，誘變育種雖然能夠通過(guò)物理或化學(xué)方法引入隨機(jī)突變，但突變體的穩(wěn)定性和遺傳風(fēng)險(xiǎn)難以控制，且篩選過(guò)程繁瑣。這些方法涉及長(zhǎng)時(shí)間的馴化和適應(yīng)，且篩選出的藻種常含不利變異，需進(jìn)一步純化。然而，純化選擇過(guò)程亦充滿挑戰(zhàn)，它需要在龐大的藻株群體中精準(zhǔn)篩選出具有穩(wěn)定耐鹽性的優(yōu)良藻種，這一過(guò)程不僅耗時(shí)耗力，而且結(jié)果易受環(huán)境條件波動(dòng)的影響。

3、為了克服上述方法的局限性，本發(fā)明提出了一種外源滲透調(diào)節(jié)分子輔助微藻耐鹽脅迫的適應(yīng)性進(jìn)化育種方法。該方法在候選藻種尚未產(chǎn)生足夠抗性時(shí)，通過(guò)添加外源甜菜堿和一氧化氮等滲透調(diào)節(jié)分子，短期內(nèi)提升其鹽抗性，從而增加其發(fā)生并累積足夠突變的概率。這種方法的優(yōu)勢(shì)在于結(jié)合了外源分子的快速調(diào)控作用和適應(yīng)性進(jìn)化的長(zhǎng)期累積效應(yīng)，能夠?qū)崿F(xiàn)基于適應(yīng)性進(jìn)化的高效篩選育種，為微藻耐鹽新品種的培育提供新的思路和方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供外源滲透調(diào)節(jié)分子輔助微藻抗鹽脅迫適應(yīng)性進(jìn)化的方法，通過(guò)外源滲透調(diào)節(jié)分子的輔助，進(jìn)行微藻抗鹽脅迫適應(yīng)性進(jìn)化育種，顯著提高了微藻的耐鹽性，同時(shí)縮短了育種周期，提高了育種效率，為耐鹽新品種微藻的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了外源滲透調(diào)節(jié)分子輔助微藻抗鹽脅迫適應(yīng)性進(jìn)化的方法，包括以下步驟：

3、a、選擇初始育種材料：選用微藻作為初始育種材料，確保藻種來(lái)源清晰、純度高；

4、b、準(zhǔn)備培養(yǎng)基：培養(yǎng)基含有低濃度外源滲透調(diào)節(jié)劑分子，其中外源滲透調(diào)節(jié)劑分子包括甜菜堿和/或硝普鈉；

5、c、接種與培養(yǎng)：將步驟a中選取的微藻接種至步驟b中的培養(yǎng)基中，在適宜條件下進(jìn)行培養(yǎng)2-4周，確保藻種能夠正常生長(zhǎng)和繁殖；

6、d、鹽脅迫壓力遞增：培養(yǎng)過(guò)程中，隨著微藻的生長(zhǎng)和對(duì)外源滲透調(diào)節(jié)劑分子的消耗，對(duì)脅迫敏感的微藻細(xì)胞逐步被淘汰，耐受性強(qiáng)的微藻細(xì)胞逐漸富集擴(kuò)增，每隔2-3周，取舊培養(yǎng)液重新接種至新培養(yǎng)基，并逐步提升新培養(yǎng)基中的鹽度，增加鹽脅迫壓力，促進(jìn)微藻的適應(yīng)性進(jìn)化；

7、e、篩選耐鹽性藻種：觀察并記錄微藻在鹽脅迫下的生長(zhǎng)情況，以生物量od值、生長(zhǎng)速率和葉綠素含量作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到篩選標(biāo)準(zhǔn)后，選取生長(zhǎng)良好、耐鹽性強(qiáng)的藻種作為候選耐鹽藻種；

8、f、藻種純化：對(duì)步驟e中篩選出的候選耐鹽藻種進(jìn)行純化，通過(guò)多次傳代和篩選，確保純化后藻種的snp突變率大于95%的數(shù)量接近原始藻種的數(shù)量，獲得純度高、耐鹽性強(qiáng)的微藻新品種。

9、進(jìn)一步地，步驟b中，培養(yǎng)基包括50-200μm的甜菜堿或25-100μm的硝普鈉或50-200μm的甜菜堿和25-100μm的硝普鈉。

10、進(jìn)一步地，步驟c中，微藻包括淡水螺旋藻、小球藻、雨生紅球藻；淡水螺旋藻的培養(yǎng)溫度為25-30℃，光照強(qiáng)度3000-6000?lux，ph?8.5-11.5；小球藻的培養(yǎng)溫度為20-25℃，光照強(qiáng)度5000-10000?lux，ph?6.5-8.0；雨生紅球藻的培養(yǎng)溫度為22-28℃，光照強(qiáng)度4000-8000?lux，ph7.0-8.5。

11、進(jìn)一步地，步驟d中，最高鹽度為30-35?g/l，每次增加5-10?g/l鹽度。

12、進(jìn)一步地，步驟e中，篩選標(biāo)準(zhǔn)還包括生長(zhǎng)速率、葉綠素含量，通過(guò)顯微鏡觀察、光譜分析進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)量。

13、進(jìn)一步地，步驟f中，藻種純化的過(guò)程通過(guò)梯度稀釋、平板分離、單細(xì)胞操作的技術(shù)實(shí)現(xiàn)；將候選耐鹽藻種在適宜條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)或者進(jìn)行保種保藏，然后通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)傳代后的藻種進(jìn)行全基因組測(cè)序分析，確保純化后的藻種完成了培養(yǎng)分離。

14、進(jìn)一步地，純化后藻種的單核苷酸多態(tài)性（snp）位點(diǎn)數(shù)量接近馴化前野生型純種的單核苷酸多態(tài)性（snp）水平，符合要求。

15、本發(fā)明還提供了上述方法在篩選耐鹽微藻新品種中的應(yīng)用。

16、本發(fā)明所述的外源滲透調(diào)節(jié)分子輔助微藻抗鹽脅迫適應(yīng)性進(jìn)化的方法的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：

17、1、本發(fā)明通過(guò)添加外源甜菜堿和一氧化氮等滲透調(diào)節(jié)分子，短期內(nèi)提升其鹽抗性，從而增加其發(fā)生并累積足夠突變的概率。這種方法結(jié)合了外源分子的快速調(diào)控作用和適應(yīng)性進(jìn)化的長(zhǎng)期累積效應(yīng)，能夠?qū)崿F(xiàn)基于適應(yīng)性進(jìn)化的高效篩選育種，為微藻耐鹽新品種的培育提供新的思路和方法。

18、2、本發(fā)明通過(guò)外源滲透調(diào)節(jié)分子的輔助，實(shí)現(xiàn)了微藻抗鹽脅迫適應(yīng)性進(jìn)化育種，顯著提高了微藻的耐鹽性，縮短了育種周期，提高了育種效率。同時(shí)篩選出的新品種在高鹽環(huán)境下具有更好的生長(zhǎng)性能和生物量積累能力，為微藻在鹽堿地等環(huán)境的應(yīng)用提供了新的解決方案。

19、下面通過(guò)附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

技術(shù)特征：

1.外源滲透調(diào)節(jié)分子輔助微藻抗鹽脅迫適應(yīng)性進(jìn)化的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟b中，培養(yǎng)基包括50-200μm的甜菜堿或25-100μm的硝普鈉或50-200μm的甜菜堿和25-100μm的硝普鈉。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟c中，微藻包括淡水螺旋藻、小球藻、雨生紅球藻；淡水螺旋藻的培養(yǎng)溫度為25-30℃，光照強(qiáng)度3000-6000?lux，ph?8.5-11.5；小球藻的培養(yǎng)溫度為20-25℃，光照強(qiáng)度5000-10000?lux，ph?6.5-8.0；雨生紅球藻的培養(yǎng)溫度為22-28℃，光照強(qiáng)度4000-8000?lux，ph7.0-8.5。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟d中，最高鹽度為30-35?g/l，每次增加5-10?g/l鹽度。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟e中，篩選標(biāo)準(zhǔn)還包括生長(zhǎng)速率、葉綠素含量，通過(guò)顯微鏡觀察、光譜分析進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)量。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟f中，藻種純化的過(guò)程通過(guò)梯度稀釋、平板分離、單細(xì)胞操作的技術(shù)實(shí)現(xiàn)；將候選耐鹽藻種在適宜條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)或者進(jìn)行保種保藏，然后通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)傳代后的藻種進(jìn)行全基因組測(cè)序分析，確保純化后的藻種完成了培養(yǎng)分離。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，純化后藻種的單核苷酸多態(tài)性snp位點(diǎn)大于95%的數(shù)量與馴化前野生型純種的單核苷酸多態(tài)性snp水平一致。

8.如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法，在篩選耐鹽微藻新品種中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及微藻育種技術(shù)領(lǐng)域，并公開了外源滲透調(diào)節(jié)分子輔助微藻抗鹽脅迫適應(yīng)性進(jìn)化的方法，包括以下步驟：選用微藻作為初始育種材料；準(zhǔn)備含有低濃度外源滲透調(diào)節(jié)劑分子的培養(yǎng)基；將微藻接種至培養(yǎng)基中，在適宜條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中，逐步增加鹽脅迫壓力，促進(jìn)微藻的適應(yīng)性進(jìn)化；篩選耐鹽性藻種；通過(guò)多次傳代和篩選，獲得純度高、耐鹽性強(qiáng)的微藻新品種。本發(fā)明采用上述的外源滲透調(diào)節(jié)分子輔助微藻抗鹽脅迫適應(yīng)性進(jìn)化的方法，通過(guò)外源滲透調(diào)節(jié)分子的輔助，進(jìn)行微藻抗鹽脅迫適應(yīng)性進(jìn)化育種，顯著提高了微藻的耐鹽性，同時(shí)縮短了育種周期，提高了育種效率，為耐鹽新品種微藻的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：邵盛熙,余春麗,張雨琴,馮宇馳,周文廣,陳贊旭,彭璇賓
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南昌大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6