本發(fā)明涉及細(xì)胞工程，具體涉及一種穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、雞傳染性支氣管炎病毒（infectious?bronchitis?virus,?ibv）在禽類養(yǎng)殖業(yè)中的重要性及研究挑戰(zhàn)。ibv屬于γ冠狀病毒，是一種高度傳染性的呼吸道疾病，主要影響雞的呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和泌尿生殖系統(tǒng)。該病毒能夠迅速在雞群中傳播，導(dǎo)致高發(fā)病率。ibv可引起雛雞生長(zhǎng)遲緩、成年雞產(chǎn)蛋量下降，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致死亡，給養(yǎng)雞場(chǎng)帶來(lái)顯著的經(jīng)濟(jì)損失。ibv在禽類養(yǎng)殖業(yè)中具有極其重要的影響，有效預(yù)防和控制ibv的傳播，對(duì)于保障雞養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展、提高經(jīng)濟(jì)效益以及維護(hù)公共健康都具有重要意義。通過(guò)加強(qiáng)生物安全措施、定期監(jiān)測(cè)和及時(shí)治療，可以有效地減少ibv的影響。

2、ibv的研究現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)。ibv能夠在多種細(xì)胞上生長(zhǎng)，但在雞胚腎細(xì)胞（chickenembryonic?kidney，cek）或雞腎細(xì)胞（chicken?kidney，ck）上才會(huì)出現(xiàn)明顯的致細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic?effect，cpe）。目前，對(duì)于ibv在細(xì)胞水平的研究主要依賴于雞胚腎細(xì)胞或雞胚。然而，目前尚未有能夠穩(wěn)定傳代的雞胚腎細(xì)胞系，這意味著每次實(shí)驗(yàn)都需要提取原代cek。原代細(xì)胞存在以下缺點(diǎn)：不同雞胚之間存在個(gè)體差異、雞胚本身的健康狀況和是否攜帶病原會(huì)影響后續(xù)研究，生長(zhǎng)緩慢、增殖能力有限，無(wú)法進(jìn)行長(zhǎng)期、大批量的實(shí)驗(yàn)。為了解決這些問(wèn)題，迫切需要制備穩(wěn)定傳代的cek細(xì)胞系，以便更好地支持ibv的研究和相關(guān)應(yīng)用。

3、有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明制備方法制備得到穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定傳代，在多次傳代后仍能保持穩(wěn)定的增殖能力，減少了個(gè)體差異，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，此外，本發(fā)明制備方法沒(méi)有引入外源基因或改變細(xì)胞自身的基因型，確保了在基因水平上的穩(wěn)定性，避免了潛在的基因突變風(fēng)險(xiǎn)。

2、為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明第一方面提供了一種穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞的制備方法，所述穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞的制備方法包括如下步驟：

4、（a）從雞胚中提取原代雞胚腎細(xì)胞；

5、（b）將原代雞胚腎細(xì)胞置于培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，即得所述穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞；

6、100?ml所述培養(yǎng)基由如下組分構(gòu)成：

7、fbs1.8~2.2?ml、naas?非必需氨基酸0.8~1.2?ml、青霉素-鏈霉素溶液0?.8~1.2ml、glutamax?0.8~1.2?ml、chir99021?40~45?μl、y27632?95~105?μl、valproic?acid?12~13?μl、dmh-1?12~14?μl、foxo1-inhibitor?1.8~2.2?μl，余量為dmem/f12培養(yǎng)基。

8、wnt信號(hào)通路是一種古老且高度保守的信號(hào)通路，其功能在胚胎發(fā)育和癌癥中尤為突出。該通路在不同動(dòng)物物種間表現(xiàn)出高度的遺傳學(xué)保守性，結(jié)構(gòu)和功能極為相似。wnt通路主要分為兩類：依賴β-連環(huán)蛋白（β-catenin）的經(jīng)典信號(hào)通路和非依賴β-catenin的非經(jīng)典信號(hào)通路。經(jīng)典wnt/β-catenin信號(hào)通路在維持細(xì)胞干性和調(diào)控細(xì)胞分化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，主要參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移和新生血管生成等過(guò)程。chir99021、valproic?acid是gsk-3β抑制劑，主要通過(guò)激活wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的增殖和自我更新。gsk-3β是wnt信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子，抑制gsk-3β可以穩(wěn)定β-catenin，使其在細(xì)胞核內(nèi)積累并激活下游基因的轉(zhuǎn)錄。dmh-1是一種bmp（骨形態(tài)發(fā)生蛋白）信號(hào)通路抑制劑，通過(guò)抑制bmp受體的活性，阻斷bmp信號(hào)的傳導(dǎo)。bmp信號(hào)通路在細(xì)胞分化和器官發(fā)育中起重要作用。y27632是一種rock（rho-associated?protein?kinase）抑制劑，主要通過(guò)抑制rock激酶活性來(lái)減少細(xì)胞凋亡和提高細(xì)胞存活率。rock在細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞遷移和細(xì)胞凋亡中起重要作用。foxo1是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、代謝和應(yīng)激反應(yīng)。foxo1-inhibitor通過(guò)抑制foxo1的活性，減少其對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。在本發(fā)明中，通過(guò)在培養(yǎng)基中加入chir99021、valproic?acid、dmh-1、y27632、foxo1-inhibitor等化合物持續(xù)激活胚胎來(lái)源的腎細(xì)胞中的經(jīng)典wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而維持細(xì)胞的干性，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的穩(wěn)定傳代。

9、優(yōu)選地，所述雞胚為16~18日齡的spf雞胚。

10、優(yōu)選地，所述傳代培養(yǎng)的溫度為38~39.5℃，二氧化碳濃度為5%。

11、優(yōu)選地，所述傳代培養(yǎng)過(guò)程中間隔2~4天更換一次培養(yǎng)基。

12、優(yōu)選地，所述傳代培養(yǎng)的傳代次數(shù)不低于40次。

13、本發(fā)明第二方面提供了一種所述穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞的制備方法制備得到的穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞。

14、本發(fā)明第三方面提供了一種上述穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞的制備方法制備得到的穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞在構(gòu)建雞傳染性支氣管炎病毒體外感染模型中的應(yīng)用。

15、本發(fā)明第四方面提供了一種雞傳染性支氣管炎病毒體外感染模型的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括采用雞傳染性支氣管炎病毒感染所述穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞的制備方法制備得到的穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞。

16、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果至少包括：

17、本發(fā)明通過(guò)激活雞胚腎細(xì)胞中的經(jīng)典wnt/β-catenin信號(hào)通路，成功構(gòu)建了一株穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞，與傳統(tǒng)的原代細(xì)胞穩(wěn)定構(gòu)建方法相比，本發(fā)明所構(gòu)建的可穩(wěn)定傳代細(xì)胞中無(wú)外源基因以插入或重組以的形式,?改變細(xì)胞自身的基因，確保了在基因水平上的穩(wěn)定性，避免了潛在的基因突變風(fēng)險(xiǎn)；此外，穩(wěn)定傳代cek細(xì)胞在多次傳代后仍能保持穩(wěn)定的增殖能力，解決了禽冠狀病毒等病原機(jī)制研究時(shí)受限于原代細(xì)胞有限傳代次數(shù)的瓶頸，同時(shí)提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性；另外，穩(wěn)定傳代cek細(xì)胞能夠滿足大規(guī)模實(shí)驗(yàn)的需求，降低了實(shí)驗(yàn)成本和工作量，減少了對(duì)新鮮雞胚的依賴，并符合動(dòng)物福利的要求。

18、本發(fā)明穩(wěn)定傳代cek細(xì)胞可以長(zhǎng)期穩(wěn)定傳代，提高了生物安全性，能夠在無(wú)菌條件下長(zhǎng)期培養(yǎng)，減少了提取和培養(yǎng)過(guò)程中引入污染的風(fēng)險(xiǎn)，確保實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的安全；而且穩(wěn)定傳代cek細(xì)胞還具有廣泛的應(yīng)用前景，可以為病毒學(xué)研究、疫苗開發(fā)、藥物篩選等領(lǐng)域提供更加穩(wěn)定和可靠的細(xì)胞模型，推動(dòng)相關(guān)研究的進(jìn)展。

技術(shù)特征：

1.一種穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞的制備方法包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述雞胚為16~18日齡的spf雞胚。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述傳代培養(yǎng)的溫度為38~39.5℃，二氧化碳濃度為5%。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述傳代培養(yǎng)過(guò)程中間隔2~4天更換一次培養(yǎng)基。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述傳代培養(yǎng)的傳代次數(shù)不低于40次。

6.權(quán)利要求1~5中任一所述的穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞的制備方法制備得到的穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞。

7.權(quán)利要求1~5中任一所述的穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞的制備方法制備得到的穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞在構(gòu)建雞傳染性支氣管炎病毒體外感染模型中的應(yīng)用。

8.一種雞傳染性支氣管炎病毒體外感染模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括采用雞傳染性支氣管炎病毒感染權(quán)利要求1~5中任一所述的穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞的制備方法制備得到的穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用，所述制備方法包括如下步驟：（a）從雞胚中提取原代雞胚腎細(xì)胞；（b）將原代雞胚腎細(xì)胞于特定培養(yǎng)基中進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)，即得穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞；本發(fā)明通過(guò)激活雞胚腎細(xì)胞中的經(jīng)典Wnt/β?catenin信號(hào)通路，成功構(gòu)建了一株穩(wěn)定傳代雞胚腎細(xì)胞，與傳統(tǒng)的原代細(xì)胞穩(wěn)定構(gòu)建方法相比，該穩(wěn)定傳代細(xì)胞中無(wú)外源基因以插入或重組以的形式,改變細(xì)胞自身的基因，確保了在基因水平上的穩(wěn)定性，避免了潛在的基因突變風(fēng)險(xiǎn)；此外穩(wěn)定傳代CEK細(xì)胞在多次傳代后仍能保持穩(wěn)定的增殖能力，解決了禽冠狀病毒等病原機(jī)制研究時(shí)受限于原代細(xì)胞有限傳代次數(shù)的瓶頸，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。

技術(shù)研發(fā)人員：覃堯,宗永泰,丁仁博,陳云
受保護(hù)的技術(shù)使用者：海南大學(xué)三亞南繁研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6