本發(fā)明屬于多肽和基因工程，更具體地涉及重組表達(dá)質(zhì)粒、構(gòu)建重組人源化膠原蛋白大腸桿菌的方法和透皮型重組人源化膠原蛋白的制備方法及其用途。

背景技術(shù)：

1、膠原蛋白是廣泛分布于人體結(jié)締組織的一類蛋白質(zhì)，也是人體中含量最多的蛋白質(zhì)，可以占到蛋白質(zhì)總量的25％～35％。它的主要功能體現(xiàn)在維護(hù)細(xì)胞外環(huán)境，維持組織器官的正常生理功能，修復(fù)肌體損傷等方面。膠原蛋白是天然的生物資源，具有其它高分子材料所望塵莫及的生物組織相容性，對(duì)細(xì)胞的支撐彈性和可降解性，因此，膠原蛋白可以廣泛的應(yīng)用在醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)中。

2、生產(chǎn)膠原蛋白的傳統(tǒng)方法是利用酸、堿、酶解法處理動(dòng)物來(lái)源的組織，提取膠原蛋白衍生物。這些方法提取的膠原蛋白本身已經(jīng)喪失了原本的生物學(xué)活性，無(wú)法應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮真正的功能。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，人們不斷嘗試?yán)棉D(zhuǎn)基因技術(shù)，在動(dòng)物、植物和微生物表達(dá)體系中制備重組人膠原蛋白，解決了傳統(tǒng)提取工藝的諸多缺點(diǎn)。國(guó)外研究機(jī)構(gòu)通過(guò)培育含人膠原蛋白基因的小鼠，得到了含有人膠原蛋白的乳汁，但是這樣生產(chǎn)的成本過(guò)高，生產(chǎn)周期過(guò)長(zhǎng)，無(wú)法投入大規(guī)模生產(chǎn)。

3、中國(guó)專利發(fā)明201210482543.2公開(kāi)了一種重組人源膠原蛋白以及其生產(chǎn)方法，其中公開(kāi)了通過(guò)接頭連接iii型膠原蛋白肽段并且在c端添加穩(wěn)定序列獲得的重組人源膠原蛋白。

4、中國(guó)專利發(fā)明201811438582.6的公開(kāi)了多肽、其生產(chǎn)方法和用途，利用了基因工程技術(shù)，構(gòu)建了一種能夠制備多肽的工程菌，并通過(guò)該工程菌生產(chǎn)多肽，并通過(guò)tev蛋白酶酶切多肽的步驟最終制備多肽，即人源化膠原蛋白；

5、本發(fā)明是基于中國(guó)專利發(fā)明201811438582?.6的公開(kāi)了多肽、其生產(chǎn)方法和用途的專利的進(jìn)一步的改進(jìn)，由于該發(fā)明需要另行添加tev蛋白酶進(jìn)行酶切多肽的步驟最終制備多肽，即人源化膠原蛋白，轉(zhuǎn)化效率低、反應(yīng)周期長(zhǎng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述問(wèn)題，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種多肽及透皮型重組人源化膠原蛋白及其用途，通過(guò)因工程技術(shù)能夠有效的解決另行添加tev蛋白酶進(jìn)行酶切多肽的步驟最終制備多肽，即人源化膠原蛋白，轉(zhuǎn)化效率低、反應(yīng)周期長(zhǎng)的問(wèn)題。

2、本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的具體技術(shù)方案為：一種重組表達(dá)質(zhì)粒，所述重組表達(dá)質(zhì)粒的載體為pcoladuet-1，所述重組表達(dá)質(zhì)粒包含：兩段編碼重組型蛋白表達(dá)產(chǎn)物基因的聚核苷酸和用于表達(dá)并拆分兩段編碼重組型蛋白表達(dá)產(chǎn)物的雙向啟動(dòng)子；

3、所述編碼重組型蛋白表達(dá)產(chǎn)物基因的聚核苷酸，包括編碼重組ii型人源膠原蛋白的聚核苷酸和編碼重組iii型人源膠原蛋白的聚核苷酸；

4、所述重組iii型人源膠原蛋白的聚核苷酸為具有n個(gè)基本重復(fù)單元的核苷酸序列，基本重復(fù)單元為如seq?no：1所示的核苷酸序列，n為大于等于6的整數(shù)，各重復(fù)序列之間是直接連接；

5、所述重組ii型人源膠原蛋白的聚核苷酸為具有m個(gè)基本重復(fù)單元的核苷酸序列，基本重復(fù)單元如seq?no：2所示的核苷酸序列；m為2-3的整數(shù)，各重復(fù)序列之間是直接連接。

6、進(jìn)一步地，所述雙向啟動(dòng)子的核苷酸序列為如seq?no：3所示的核苷酸序列；

7、進(jìn)一步地，一種利用重組表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建重組人源化膠原蛋白大腸桿菌的方法；

8、第1步：利用引物1和引物2將重組ii型人源膠原蛋白的聚核苷酸，正向連接到載體pcoladuet-1上，構(gòu)建表達(dá)載體pcola-iolm；

9、第2步：利用引物3和引物4，將雙向啟動(dòng)子的核苷酸序列，連接到表達(dá)載體pcola-iolm上，構(gòu)建表達(dá)載體pcola-iolm-pla；

10、第3步：利用引物5和引物6，將重組iii型人源膠原蛋白的聚核苷酸，反向連接到表達(dá)載體pcola-iolm-pla上，構(gòu)建表達(dá)載體pcola-iolm-pla-iolg；

11、第4步：將步驟3中構(gòu)建的表達(dá)載體pcola-iolm-pla-iolg導(dǎo)入宿主細(xì)胞大腸桿菌中，得到重組人源化膠原蛋白大腸桿菌。

12、其中，引物1的dna序列為：seq?no：4；所示的核苷酸序列為

13、3’-cgtcatatgaaaaacatcaccatcggaatgg-5’；

14、引物2的dna序列為：seq?no：5；所示的核苷酸序列為

15、3’-gctggtacctcattaagcagatggaaccagcgcac-5’；

16、引物3的dna序列為：seq?no：6；所示的核苷酸序列為

17、3’-gctggatccaggatgtctcagagaagtaagtac-5’；

18、引物4的dna序列為：seq?no：7；所示的核苷酸序列為

19、3’-gcagtcgacttaggctattacatcgcgacgtttcc-5’。

20、引物5的dna序列為：seq?no：8；所示的核苷酸序列為

21、3’-cgccatggtcatgactcttcgtatcgcccttttcg-5’；

22、引物6的dna序列為：seq?no：9；所示的核苷酸序列為

23、3’-gctggatccttactaaacgttggcagggttgaggg-5’。

24、一種透皮型重組人源化膠原蛋白的制備方法，在生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述重組人源化膠原蛋白大腸桿菌，

25、（1）挑取優(yōu)選后的重組人源化膠原蛋白大腸桿菌單菌落，置于lb培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過(guò)夜；

26、（2）將菌液按照1：100接種放大培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3小時(shí)，加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)，20℃繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)，離心收集菌體；

27、（3）收獲重組ii型人源膠原蛋白和重組iii型人源膠原蛋白；

28、（4）通過(guò)ni柱和/或陰離子交換層析純化得到透皮型重組人源化膠原蛋白。

29、進(jìn)一步地，所述誘導(dǎo)劑為半乳糖。

30、進(jìn)一步地，所述透皮型重組人源化膠原蛋白具有透皮性能。

31、進(jìn)一步地，所述透皮型重組人源化膠原蛋白用于化妝品或保健品

32、本發(fā)明的有益效果是：

33、本發(fā)明創(chuàng)造地制備一種重組表達(dá)質(zhì)粒，并構(gòu)建了重組人源化膠原蛋白大腸桿菌，在誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下，雙向啟動(dòng)子引發(fā)重組iii型人源膠原蛋白的聚核苷酸和重組iii型人源膠原蛋白的聚核苷酸同時(shí)進(jìn)行表達(dá)和拆分，避免了同向表達(dá)的干擾；并生產(chǎn)重組ii型人源膠原蛋白和重組iii型人源膠原蛋白，

34、本發(fā)明創(chuàng)造地制備透皮型重組人源化膠原蛋白，包含了拆分獲得的重組ii型人源膠原蛋白和重組iii型人源膠原蛋白，具有優(yōu)越的透皮效果；

35、本發(fā)明創(chuàng)造地制備透皮型重組人源化膠原蛋白，包含了拆分獲得的重組ii型人源膠原蛋白和重組iii型人源膠原蛋白，重組ii型人源膠原蛋白和重組iii型人源膠原蛋白協(xié)同作用具有更為優(yōu)越的膠原蛋白的再生能力。

技術(shù)特征：

1.一種透皮型重組人源化膠原蛋白的制備方法，其特征在于：在生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)利用重組人源化膠原蛋白大腸桿菌制備，包括

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的透皮型重組人源化膠原蛋白的制備方法，其特征在于所述誘導(dǎo)劑為半乳糖。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的透皮型重組人源化膠原蛋白的制備方法，其特征在于所述透皮型重組人源化膠原蛋白具有透皮性能。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的透皮型重組人源化膠原蛋白的制備方法，其特征在于所述透皮型重組人源化膠原蛋白用于化妝品或保健品。

5.一種重組表達(dá)質(zhì)粒，所述重組表達(dá)質(zhì)粒的載體為pcoladuet-1，其特征在于用于構(gòu)建權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述重組人源化膠原蛋白大腸桿菌，

6.?根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于所述雙向啟動(dòng)子的核苷酸序列為如seq?no：3所示的核苷酸序列。

7.一種構(gòu)建重組人源化膠原蛋白大腸桿菌的方法；其特征在于：利用權(quán)利要求5的所述重組表達(dá)質(zhì)粒，

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的構(gòu)建重組人源化膠原蛋白大腸桿菌的方法，其特征在于所述

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組表達(dá)質(zhì)粒、構(gòu)建重組人源化膠原蛋白大腸桿菌的方法和透皮型重組人源化膠原蛋白的制備方法及其用途，屬于多肽和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，構(gòu)建了重組人源化膠原蛋白大腸桿菌，在誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下，雙向啟動(dòng)子引發(fā)重組III型人源膠原蛋白的聚核苷酸和重組III型人源膠原蛋白的聚核苷酸同時(shí)進(jìn)行表達(dá)和拆分；并生產(chǎn)重組II型人源膠原蛋白和重組III型人源膠原蛋白，本發(fā)明的有益效果是：避免了同向表達(dá)的干擾；并生產(chǎn)重組II型人源膠原蛋白和重組III型人源膠原蛋白，重組II型人源膠原蛋白和重組III型人源膠原蛋白協(xié)同作用具有更為優(yōu)越的膠原蛋白的再生能力和優(yōu)越的透皮效果。

技術(shù)研發(fā)人員：姜海超,孟祥瑞,王昌猛,杜秀麗,田慧敏
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山東義才和銳生物技術(shù)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6