本發(fā)明涉及類器官培養(yǎng)，更具體地說，它涉及一種胃腸腫瘤類器官的培養(yǎng)體系、培養(yǎng)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、胃癌和腸癌是我國臨床中常見的惡性腫瘤，發(fā)病率及死亡率均高居前列。但目前，個體之間的抗腫瘤療效存在著較大差異，因此需要良好的臨床前模型評價藥物療效，目前主要的臨床前模型為細(xì)胞系模型和患者來源的腫瘤異種移植動物模型（pdx），但來源于同質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞系模型無法模擬人源性腫瘤的微環(huán)境，而動物模型存在著實驗復(fù)雜度高，周期長等特點。而近年來新興的類器官制備培養(yǎng)技術(shù)，其具有自我組織形成類似于原始組織的“微型器官”的能力，因此腫瘤患者來源的類器官模型與體內(nèi)器官和組織高度相似，可以較好的保留親本腫瘤基因突變譜，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)在保留腫瘤原代信息、模擬治療反應(yīng)預(yù)測方面的不足。

2、但目前，胃腸腫瘤類器官培養(yǎng)體系還存在著成功率不夠高的情況，相關(guān)研究表明胃癌類器官的培養(yǎng)成功率在31-70.9%，腸癌類器官的培養(yǎng)成功率在68-85.7%，同時現(xiàn)有的胃腸腫瘤類器官培養(yǎng)體系存在著原代細(xì)胞存活率不高、傳代后增殖率下降等問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有胃腸腫瘤類器官培養(yǎng)體系下原代類器官的存活率較低以及傳代后的增殖率下降的難題，本發(fā)明的目的是提供一種胃腸腫瘤類器官的培養(yǎng)體系。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、一種胃腸腫瘤類器官的培養(yǎng)體系，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和抗氧化活性中藥提取物；所述抗氧化活性中藥提取物為虎杖苷、柚皮苷中的一種或兩種。

4、已有研究表明，柚皮苷具備清除自由基，增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化物質(zhì)超氧化物歧化酶（superoxide?dismutase，sod）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione?peroxidase，gpx）活性的能力，從而改善抗氧化機(jī)能，促進(jìn)細(xì)胞和組織生長?；⒄溶湛赏ㄟ^清除體內(nèi)自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、提高抗氧化酶活性以及調(diào)節(jié)抗氧化物質(zhì)水平等多種方式，發(fā)揮抗氧化作用，保護(hù)細(xì)胞、組織并增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力。

5、發(fā)明人研究表明，在現(xiàn)有的胃腸腫瘤類器官培養(yǎng)基中添加柚皮苷或虎杖苷，可以增加胃腸腫瘤類器官的原代培養(yǎng)存活率以及傳代后的增殖能力，為后續(xù)的抗腫瘤治療提供更好的體外研究模型。而在現(xiàn)有的胃腸腫瘤類器官培養(yǎng)基中添加同樣具有抗氧化活性作用的槲皮素，在某些濃度下反而起到反作用。

6、優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以advanced?dmem/f12培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，其含有終濃度為1%的?glutamax，1.25mmol/l的n-acetyl-l-cysteine，20～100ng/ml的wnt-3a，100ng/mlr-spondin?1，100ng/ml的noggin?，10mmol/l的hepes，1×的n2和b27，10mmol/l的nicotinamide，5～10nmol/l的gastrin，50ng/ml的egf，100ng/ml的?fgf10，5μmol/l的a8301，3μmol/l的chir99021和10μmol/l的?y27632。

7、具體地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以advanced?dmem/f12培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，其含有的glutamax的終濃度為1%，n-acetyl-l-cysteine的終濃度為1.25mmol/l，wnt-3a的終濃度為20～100ng/ml，其余組分類似設(shè)置。

8、優(yōu)選地，當(dāng)所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基用于培養(yǎng)胃癌類器官時，wnt-3a的終濃度為100ng/ml，gastrin的終濃度為10nmol/l。

9、優(yōu)選地，當(dāng)所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基用于培養(yǎng)腸癌類器官時，wnt-3a的終濃度為20ng/ml，gastrin的終濃度為5nmol/l。

10、優(yōu)選地，所述抗氧化活性中藥提取物以終濃度500ng/ml添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。

11、優(yōu)選地，所述抗氧化活性中藥提取物為柚皮苷。

12、本發(fā)明的另一目的是提供一種胃腸腫瘤類器官的培養(yǎng)方法，其包括以下步驟：獲取新鮮胃癌組織或腸癌組織的腫瘤細(xì)胞；將腫瘤細(xì)胞重懸至預(yù)冷的且由腫瘤類器官培養(yǎng)基與matrigel基質(zhì)膠按體積比1:2組成的混合液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為2500～4000?cells/50μl，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中；將細(xì)胞培養(yǎng)板置于?37℃、5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中固化25min，然后利用本發(fā)明前述提供的培養(yǎng)體系對胃腸癌類器官進(jìn)行體外培養(yǎng)，2～3天更換一次相應(yīng)的培養(yǎng)體系，培養(yǎng)10天后光鏡下觀察類器官形態(tài)。

13、本發(fā)明的又一目的是提供一種胃腸腫瘤類器官的培養(yǎng)體系的應(yīng)用，利用前述的培養(yǎng)體系及其培養(yǎng)的胃腸癌類器官對小分子靶向抗腫瘤藥物進(jìn)行藥篩。

14、本發(fā)明具有以下有益效果：通過在胃腸腫瘤類器官培養(yǎng)體系中添加具備抗氧化活性的中藥提取物柚皮苷或虎杖苷，優(yōu)化了胃腸腫瘤類器官的體外培養(yǎng)條件，使得胃腸腫瘤類器官具有更高的存活率，更強(qiáng)的增殖能力，并為后續(xù)的抗腫瘤治療提供了良好的體外研究模型。

技術(shù)特征：

1.一種胃腸腫瘤類器官的培養(yǎng)體系，其特征在于，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和抗氧化活性中藥提取物；所述抗氧化活性中藥提取物為虎杖苷、柚皮苷中的一種或兩種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)體系，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以advanced?dmem/f12培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，其含有終濃度為?1%的?glutamax，1.25mmol/l的n-acetyl-l-cysteine，20～100ng/ml的wnt-3a，100ng/ml?r-spondin?1，100ng/ml的noggin?，10mmol/l的hepes，1×的n2和b27，10mmol/l的?nicotinamide，5～10nmol/l的gastrin，50ng/ml的egf，100ng/ml的?fgf10，5μmol/l的a8301，3μmol/l的chir99021和10μmol/l的?y27632。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)體系，其特征在于，當(dāng)所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基用于培養(yǎng)胃癌類器官時，wnt-3a的終濃度為100ng/ml，gastrin的終濃度為10nmol/l。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)體系，其特征在于，當(dāng)所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基用于培養(yǎng)腸癌類器官時，wnt-3a的終濃度為20ng/ml，gastrin的終濃度為5nmol/l。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)體系，其特征在于，所述抗氧化活性中藥提取物以終濃度500ng/ml添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)體系，其特征在于，所述抗氧化活性中藥提取物為柚皮苷。

7.一種胃腸腫瘤類器官的培養(yǎng)方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1～6任一項所述的培養(yǎng)體系對胃腸癌類器官進(jìn)行體外培養(yǎng)。

8.一種胃腸腫瘤類器官的培養(yǎng)體系的應(yīng)用，其特征在于，利用權(quán)利要求1～6任一項所述的培養(yǎng)體系及其培養(yǎng)的胃腸癌類器官對小分子靶向抗腫瘤藥物進(jìn)行藥篩。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及類器官培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，首次涉及一種胃腸腫瘤類器官的培養(yǎng)體系及培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)體系通過在現(xiàn)有培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上加入柚皮苷、或虎杖苷等抗氧化活性中藥提取物組成，利用此培養(yǎng)體系對胃腸腫瘤類器官進(jìn)行培養(yǎng)可以提高胃腸腫瘤類器官的原代存活率以及傳代后的增殖率。此外，本發(fā)明還提供一種胃腸腫瘤類器官的培養(yǎng)體系的應(yīng)用，利用所述培養(yǎng)體系及其培養(yǎng)的胃腸癌類器官對小分子靶向抗腫瘤藥物進(jìn)行藥篩，為后續(xù)的抗腫瘤治療提供更好的體外研究模型。

技術(shù)研發(fā)人員：雷增杰,傅恭博,戴哲,褚曉源
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6