本發(fā)明屬于生物工程領域，具體涉及一種半乳糖氧化酶突變體及其在制備2-氧代-2-呋喃基乙酸中的應用。

背景技術：

1、呋喃銨鹽，化學名稱為(z)-2-甲氧亞氨基-2-呋喃基乙酸銨，是合成頭孢呋辛的關鍵中間體，可由2-氧代-2-呋喃基乙酸與甲氧基胺進行肟化反應制得。

2、2-氧代-2-呋喃基乙酸作為合成呋喃銨鹽的關鍵前體原料，目前主要通過化學方法制備，常見的路線為糠酸經(jīng)過氯化制得呋喃甲酰氯，呋喃甲酰氯發(fā)生氰化反應，然后在酸性條件下水解制得2-氧代-2-呋喃基乙酸。但是該工藝會產(chǎn)生大量的有毒氣體，操作危險，且三廢處理困難。

3、近年來，由于生物酶法具有安全高效，成本低廉，立體選擇性專一且對環(huán)境更加友好等優(yōu)勢，因此，生物酶法合成2-氧代-2-呋喃基乙酸工業(yè)成為主要研究方法，比如，專利cn116355974a中即報道了氧化酶可以催化2-呋喃基羥基甲基酮生成2-氧代-2-呋喃基乙酸，但是其并未披露具體的酶種及酶的生產(chǎn)工藝。

4、然而，目前已報道能夠徹底氧化底物2-呋喃基羥基甲基酮生成氧化產(chǎn)物羧酸的氧化酶存在催化效率低、產(chǎn)物產(chǎn)量低等問題。

5、因此，若是能開發(fā)出一種催化能力更強的生物酶用于轉化生產(chǎn)2-氧代-2-呋喃基乙酸，將極大的提高頭孢呋辛工業(yè)化制備效率，對頭孢呋辛市場的發(fā)展具有重要意義。

技術實現(xiàn)思路

1、為了解決上述的技術問題，本發(fā)明提供了一種半乳糖氧化酶突變體及其在制備2-氧代-2-呋喃基乙酸中的應用。

2、本發(fā)明開發(fā)了一種能夠高效催化2-呋喃基羥基甲基酮反應制備2-氧代-2-呋喃基乙酸的半乳糖氧化酶突變體，此外，與該半乳糖氧化酶突變體對應的氨基酸序列、核苷酸序列、能夠誘導表達該半乳糖氧化酶突變體的重組表達質粒、基因工程菌株及其制備方法同樣是本發(fā)明保護的重點。

3、本發(fā)明所提供的一種半乳糖氧化酶突變體，所述的半乳糖氧化酶突變體是對半乳糖氧化酶seq?id?no:1所示的氨基酸序列（編碼該半乳糖氧化酶的核苷酸序列，如seq?idno:2所示）進行突變獲得，所述半乳糖氧化酶突變體序列選擇如下序列之一：

4、（1）將seq?id?no:1所示氨基酸序列的第193位丙氨酸替換為蘇氨酸；

5、（2）將seq?id?no:1所示氨基酸序列的第195位谷氨酸替換為絲氨酸；

6、（3）將seq?id?no:1所示氨基酸序列的第290位色氨酸替換為苯丙氨酸；

7、（4）將seq?id?no:1所示氨基酸序列的第291位絲氨酸替換為丙氨酸；

8、（5）將seq?id?no:1所示氨基酸序列的第326位谷氨酰胺替換為天冬氨酸；

9、（6）將seq?id?no:1所示氨基酸序列的第406位蘇氨酸替換為纈氨酸；

10、（7）包含上述（1）-（6）中至少兩個位點的氨基酸殘基的突變體。

11、其中，本發(fā)明所提供的催化效果最佳的半乳糖氧化酶突變體，其蛋白質的氨基酸序列為如seq?id?no:3所示的氨基酸序列，即將seq?id?no:1所示氨基酸序列的第193位丙氨酸替換為蘇氨酸、第195位谷氨酸替換為絲氨酸、第290位色氨酸替換為苯丙氨酸、第291位絲氨酸替換為丙氨酸、第326位谷氨酰胺替換為天冬氨酸、第406位蘇氨酸替換為纈氨酸。

12、編碼上述半乳糖氧化酶突變體的基因，其核苷酸序列如seq?id?no:4中所示。

13、此外，本發(fā)明還提供了上述的半乳糖氧化酶突變體的制備方法，包括如下步驟：半乳糖氧化酶編碼基因定點突變，構建表達載體，轉化蛋白表達宿主菌，誘導蛋白表達。

14、進一步的，本發(fā)明利用分子克隆技術獲得了突變體的編碼基因，并通過構建突變體基因的6×his融合表達載體并導入基因工程菌 e.colibl21?(de3)中誘導表達，獲得突變體酶蛋白，以突變體為催化劑、在適當?shù)臈l件下進行酶催化反應轉化制備的2-呋喃基羥基甲基酮。結果表明，本發(fā)明提供的突變體催化效率較半乳糖氧化酶fggoasem7-2a提高了46.4倍，合成2-氧代-2-呋喃基乙酸產(chǎn)率為104?mm，在2-氧代-2-呋喃基乙酸的工業(yè)生產(chǎn)中有巨大的應用潛力和價值。

15、本發(fā)明以上所提及的所有突變位點及任意組合突變編碼半乳糖氧化酶突變體的基因，包括但不限于任何對上述所示氨基酸序列中氨基酸經(jīng)過替換一個或幾個氨基酸且對底物2-呋喃基羥基甲基酮有活性的，均為本發(fā)明所要重點保護的內容。此外，包含所述基因的表達盒﹑載體或者重組菌同樣落入本發(fā)明所保護的技術范圍中。

16、同理，包含了上述半乳糖氧化酶突變體的催化劑，同樣是本發(fā)明所保護的技術內容。

17、更進一步地，本發(fā)明提供的上述半乳糖氧化酶突變體或包含了上述半乳糖氧化酶突變體的催化劑在以糠醛和甲醛為初始原料制備2-氧代-2-呋喃基乙酸中的應用，具體是以糠醛和甲醛為底物合成2-呋喃基羥基甲基酮，再以制備的2-呋喃基羥基甲基酮底物進行催化反應，合成2-氧代-2-呋喃基乙酸，同樣是本發(fā)明所保護的技術內容。

18、所述的應用具體是：使用上述的半乳糖氧化酶突變體或包含了上述半乳糖氧化酶突變體的催化劑，以2-呋喃基羥基甲基酮為底物，在cu2+、過氧化氫酶、辣根過氧化物酶、磷酸緩沖液存在下，在反應溫度20~30℃的條件下進行催化反應合成2-氧代-2-呋喃基乙酸。

19、本發(fā)明的有益效果在于：

20、（1）通過對半乳糖氧化酶fggoasem7-2a進行改造，獲得了高活性的半乳糖氧化酶突變體fggoasem7-2a/a193t/e195s/w290f/s291a/q326d/t406v，催化效率在91.84~119.96?mm-1s-1的范圍中，相較于半乳糖氧化酶fggoasem7-2a，半乳糖氧化酶突變體催化效率提升46.4倍；

21、（2）本發(fā)明中篩選得到的半乳糖氧化酶突變體在催化2-呋喃基羥基甲基酮制備2-氧代-2-呋喃基乙酸的反應中，具有良好的催化活性，產(chǎn)量高達104?mm，轉化率為86.7%，實現(xiàn)了以糠醛和甲醛為初始原料生產(chǎn)2-氧代-2-呋喃基乙酸的高效催化，顯著提高了2-氧代-2-呋喃基乙酸的生產(chǎn)效率。

技術特征：

1.一種半乳糖氧化酶突變體，其特征在于，所述的半乳糖氧化酶突變體是對半乳糖氧化酶seq?id?no:1所示的氨基酸序列進行突變獲得，所述半乳糖氧化酶突變體序列選擇如下序列之一：

2.編碼權利要求1所述的半乳糖氧化酶突變體的基因。

3.一種重組表達載體，其特征在于，所述的重組表達載體包含編碼權利要求1中所述的半乳糖氧化酶突變體氨基酸序列的核苷酸序列。

4.重組工程菌，其特征在于，所述的重組工程菌是通過將權利要求3所述的重組表達載體轉化至宿主微生物中獲得的。

5.權利要求1所述的半乳糖氧化酶突變體或者權利要求4所述的重組工程菌在以2-呋喃基羥基甲基酮為底物，制備2-氧代-2-呋喃基乙酸中的應用。

6.制備2-氧代-2-呋喃基乙酸的方法，其特征在于，包括以下的步驟：

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，（2）中，所述的催化反應的反應條件為：在cu2+、過氧化氫酶、辣根過氧化物酶、磷酸緩沖液存在的條件下，于20~30℃進行反應。

技術總結
本發(fā)明屬于生物工程領域，具體涉及一種半乳糖氧化酶突變體及其在制備2?氧代?2?呋喃基乙酸中應用。本發(fā)明對來自F.graminearum的半乳糖氧化酶進行酶的改造，獲得了具有高活性的半乳糖氧化酶突變體。本發(fā)明篩選得到的半乳糖氧化酶突變體FgGOase<subgt;M7?2A</subgt;/A193T/E195S/W290F/S291A/Q326D/T406V在催化2?呋喃基羥基甲基酮在制備2?氧代?2?呋喃基乙酸的反應中，具有良好的催化效率，催化效率在91.84~119.96?mM<supgt;?1</supgt;S<supgt;?1</supgt;的范圍內，同時，在100?mL制備級反應中的轉化率為86.7%，產(chǎn)量為104?mM。

技術研發(fā)人員：馬欽元,張同,魏浩,高秀珍,張紫嫣,陳良清,馬志鑫
受保護的技術使用者：山東理工大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/6