本發(fā)明屬于基因工程，具體地，本申請涉及一種玉米耐鹽堿分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、鹽堿脅迫是自然界中最常見的非生物脅迫之一,由于它分布廣泛，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了極大的負(fù)面影響(munns&tester,2008；zhu,2016)。深入研究主要作物適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境的分子機(jī)制，鑒定可用于作物耐鹽堿改良的基因，培育耐鹽堿農(nóng)作物品種，是保障我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和國家糧食安全的必要舉措。

2、耐鹽堿應(yīng)答過程主要包括去離子毒害和滲透調(diào)節(jié)兩個方面。當(dāng)生長在鹽脅迫條件下，植物根系會吸收過量的na+，同時抑制k+吸收，導(dǎo)致組織中k+/na+比率失衡，產(chǎn)生離子毒害，進(jìn)而產(chǎn)生滲透脅迫。因此維持na+、k+穩(wěn)態(tài)對植物耐鹽堿能力的形成有重要的意義(munnsand?tester,2008；yang?and?guo,2018)。玉米是我國種植面積最廣的農(nóng)作物，對鹽脅迫敏感(王麗燕，2005)。已有研究表明，玉米自然群體有著豐富的遺傳多樣性，不同玉米自交系的耐鹽堿性存在差異，表明玉米自然群體中存在豐富的遺傳變異，可應(yīng)用于耐鹽堿遺傳改良(zhang?et?al.,2019；luo?et?al.,2019)。隨著全基因組關(guān)聯(lián)分析(gwas)和數(shù)量性狀基因組(qtl)分析方法在玉米耐鹽堿基因挖掘方面的不斷應(yīng)用，挖掘了一系列與耐鹽堿性變異相關(guān)的遺傳位點(diǎn)，但到目前為止只有為數(shù)不多的玉米耐鹽堿qtl基因被克隆，玉米耐鹽堿分子標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用也比較少。因此，挖掘和克隆耐鹽堿qtl基因并解析其耐鹽堿機(jī)制，開發(fā)新的耐鹽堿分子標(biāo)記并應(yīng)用于玉米耐鹽堿育種，對耐鹽堿玉米培育具有重要的基因資源支撐和應(yīng)用價值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、一方面，本申請?zhí)峁┝艘环N玉米耐鹽堿分子標(biāo)記，所述玉米耐鹽堿分子標(biāo)記的核苷酸序列為seq?id?no.6。

2、進(jìn)一步地，所述玉米耐鹽堿分子標(biāo)記位于玉米2號染色體上。

3、進(jìn)一步地，所述玉米耐鹽堿分子標(biāo)記通過使用以下引物對擴(kuò)增玉米基因組dna獲得：zmnc3-n-marker-f1：cctcgacctctccacact；

4、zmnc3-n-marker-r1：cataacgtgaactgcgatgc。

5、另一方面，本申請?zhí)峁┝藱z測上述玉米耐鹽堿分子標(biāo)記的引物對，所述引物對的核苷酸序列為：

6、zmnc3-n-marker-f1：cctcgacctctccacact；

7、zmnc3-n-marker-r1：cataacgtgaactgcgatgc。

8、另一方面，本申請?zhí)峁┝艘环N用于鑒定玉米是否耐鹽堿的試劑盒，所述試劑盒包含上述引物對。

9、另一方面，本申請?zhí)峁┝髓b定玉米是否耐鹽堿的方法，所述方法包括：

10、(1)提取待測玉米的基因組dna；

11、(2)使用以下引物對擴(kuò)增玉米基因組dna：

12、zmnc3-n-marker-f1：cctcgacctctccacact；

13、zmnc3-n-marker-r1：cataacgtgaactgcgatgc；

14、(3)根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判斷待測玉米是否耐鹽堿：如果擴(kuò)增得到100bp的片段，則待測玉米為耐鹽堿型；如果擴(kuò)增得到121bp的片段，則待測玉米為鹽堿敏感型。

15、所述步驟(2)可以使用上述試劑盒進(jìn)行。

16、進(jìn)一步地，步驟(2)擴(kuò)增所用的pcr體系為20μl體系，包括2×super?multiplexpcr?mix10μl、10μm?primer?zmnc3-n-marker-f1?1μl、10μm?primer?zmnc3-n-marker-r1?1μl、玉米基因組dna?1μl、ddh2o?7μl。

17、進(jìn)一步地，步驟(2)擴(kuò)增所用的pcr程序為：首先，95℃預(yù)變性5min；隨后，進(jìn)行34個循環(huán)：95℃變性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s；最后72℃延伸5min。

18、進(jìn)一步地，步驟(3)中通過電泳來觀察擴(kuò)增結(jié)果。

19、進(jìn)一步地，步驟(1)中從待測玉米中提取待測玉米的基因組dna。

20、另一方面，本申請?zhí)峁┝松鲜龇肿訕?biāo)記、試劑盒、方法在耐鹽堿玉米育種中的應(yīng)用。

21、進(jìn)一步地，所述應(yīng)用中選用耐鹽堿的玉米植株或種子進(jìn)行育種。

22、提取玉米基因組dna可以使用ctab法等方法，或者使用市售試劑盒進(jìn)行，所用的樣本可以為種子、不同生長階段的莖、葉、果實(shí)等部分。

23、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一段核酸序列可作為分子標(biāo)記，用于判定玉米是否為耐鹽堿。由于玉米耐鹽堿是數(shù)量性狀遺傳，表型分析耗時費(fèi)力，本發(fā)明中的玉米耐鹽堿分子標(biāo)記、引物對和試劑盒都可以應(yīng)用于玉米耐鹽堿育種中，在玉米種子期間或子葉長出的早期階段就可進(jìn)行鑒定，省時且準(zhǔn)確，可以加速玉米耐鹽堿品種選育進(jìn)程。

技術(shù)特征：

1.一種玉米耐鹽堿分子標(biāo)記，所述玉米耐鹽堿分子標(biāo)記的核苷酸序列為seq?id?no.6。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米耐鹽堿分子標(biāo)記，所述玉米耐鹽堿分子標(biāo)記位于玉米2號染色體上。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的玉米耐鹽堿分子標(biāo)記，所述玉米耐鹽堿分子標(biāo)記通過使用以下引物對擴(kuò)增玉米基因組dna獲得：

4.檢測根據(jù)權(quán)利要求1所述玉米耐鹽堿分子標(biāo)記的引物對，其特征在于，所述引物對的核苷酸序列為：

5.一種用于鑒定玉米是否耐鹽堿的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含根據(jù)權(quán)利要求4所述的引物對。

6.鑒定玉米是否耐鹽堿的方法，其特征在于，所述方法包括：

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中步驟(2)擴(kuò)增所用的pcr體系為20μl體系，包括2×super?multiplex?pcr?mix?10μl、10μm?primer?zmnc3-n-marker-f1?1μl、10μm?primerzmnc3-n-marker-r1?1μl、玉米基因組dna?1μl、ddh2o?7μl。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中步驟(3)中通過電泳來觀察擴(kuò)增結(jié)果。

9.提供了根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的玉米耐鹽堿分子標(biāo)記，根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，或者根據(jù)權(quán)利要求5-8任一項所述的方法在耐鹽堿玉米育種中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，所述應(yīng)用中選用耐鹽堿的玉米植株或種子進(jìn)行育種。

技術(shù)總結(jié)
本申請?zhí)峁┝艘环N玉米耐鹽堿分子標(biāo)記及其應(yīng)用，所述分子標(biāo)記位于玉米2號染色體的chr2:11471394上，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.6。該分子標(biāo)記及其檢測試劑可應(yīng)用于玉米耐鹽堿育種中，在玉米種子期間或子葉長出的早期階段就可進(jìn)行鑒定，加速玉米耐鹽堿品種選育進(jìn)程。

技術(shù)研發(fā)人員：蔣才富,梁曉燕
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/28