本發(fā)明涉及一種起始加帽寡核苷酸引物，具體涉及一種含hna結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在真核細(xì)胞中，除了識(shí)別蛋白質(zhì)合成的起始之外，5’端帽子結(jié)構(gòu)還充當(dāng)從5’到3’外切核酸酶切割的保護(hù)基團(tuán)，即有抗5’-核酸外切酶的降解作用。同時(shí)在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中，帽子結(jié)構(gòu)也是募集蛋白質(zhì)因子以進(jìn)行前體mrna剪接、聚腺苷酸化和核輸出的唯一標(biāo)識(shí)符，也充當(dāng)募集起始因子的錨點(diǎn)，有助于核糖體對(duì)mrna的識(shí)別和結(jié)合，使翻譯得以正確起始。

2、目前，mrna的免疫原性問(wèn)題依然是該研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。5’位帽子結(jié)構(gòu)是降低免疫原性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，因此還需要設(shè)計(jì)更多的帽子結(jié)構(gòu)來(lái)更好地降低免疫原性。

3、目前已有相關(guān)的帽子專(zhuān)利來(lái)優(yōu)化結(jié)構(gòu)，并可以起到一定的效果。但是，不斷優(yōu)化帽類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)比目前已有的帽子免疫原性更低的新型帽類(lèi)似物仍是當(dāng)今科研應(yīng)用的潮流。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種含hna結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物及其制備方法和應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)的含hna結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物屬于一種新物質(zhì)，該含hna結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物能夠用于t7?rna聚合酶體系下的mrna加帽。

2、與現(xiàn)有帽結(jié)構(gòu)類(lèi)似物clean?cap相比，本發(fā)明的含hna結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物其生產(chǎn)的mrna更低的免疫原性。

3、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種含hna結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物，該含hna結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物的結(jié)構(gòu)如式i所示：

4、

5、式i中，r1和r2各自獨(dú)立地選自h、me、甲氧乙基（moe）或f；x選自o、s或se；base選自腺嘌呤堿基、鳥(niǎo)嘌呤堿基、胞嘧啶堿基、5-甲基胞嘧啶堿基或尿嘧啶。

6、本發(fā)明的另一目的是提供一種所述的含hna結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物的合成方法，該合成方法包含：

7、

8、將二核苷酸和中間體m7gmp-im溶解在含有mgcl2的有機(jī)溶劑a中，在室溫下攪拌反應(yīng)；待反應(yīng)結(jié)束后，終止反應(yīng)，純化，得到結(jié)構(gòu)如式i所示的含hna結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物。

9、優(yōu)選地，所述終止反應(yīng)，加入edta-na溶液終止反應(yīng)。

10、優(yōu)選地，所述純化采用deae柱。

11、優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑a選自dmf。

12、優(yōu)選地，所述二核苷酸的合成方法包含：

13、

14、將hna亞磷酰胺單體、2’,3’-二乙?；B(niǎo)苷于有機(jī)溶劑b中，在惰性氣體氛圍下加入四氮唑，升溫至25±2℃反應(yīng)；待反應(yīng)完成后，將含碘的二氯甲烷溶液加入到反應(yīng)液中，監(jiān)測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，加入三氟乙酸脫dmtr，監(jiān)測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，旋干，過(guò)硅膠柱得到中間體1；將所述中間體1溶解在有機(jī)溶劑c中，加入膦試劑、四氮唑充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)，監(jiān)測(cè)反應(yīng)結(jié)束后加入含碘的二氯甲烷溶液，監(jiān)測(cè)反應(yīng)結(jié)束后旋干，在旋瓶中加入甲醇和濃氨水，40℃反應(yīng)，監(jiān)測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后旋干，加入超純水，離子樹(shù)脂純化，濃縮凍干得磷酸酯鍵連接的二核苷酸。

15、優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑b選自二氯甲烷；所述有機(jī)溶劑c選自乙腈。

16、優(yōu)選地，所述中間體m7gmp-im的合成方法包含：

17、

18、a）將m7g加熱溶解在磷酸三甲酯中，反應(yīng)液冷卻至0±5℃，緩慢滴加三氯氧磷，室溫反應(yīng)后，加入三乙胺-冰乙酸溶液淬滅反應(yīng)，凍干得目標(biāo)化合物鳥(niǎo)苷單磷酸三乙胺鹽gmp.tea；

19、b）將鳥(niǎo)苷單磷酸三乙胺鹽gmp.tea與三苯基膦、二硫二吡啶、咪唑、三乙胺懸浮于有機(jī)溶劑d中，室溫反應(yīng)，反應(yīng)完全后加入高氯酸鈉丙酮溶液，抽濾，濾餅用丙酮充分洗滌，得到目標(biāo)化合物鳥(niǎo)苷單磷酸咪唑鹽gmp.im；

20、c）將鳥(niǎo)苷單磷酸咪唑鹽gmp.im懸浮在有機(jī)溶劑e中，加入磷酸三乙胺，室溫?cái)嚢?，反?yīng)完全后一鍋法投入下步反應(yīng)，加入三苯基膦、二硫二吡啶、咪唑、tea，室溫反應(yīng)，hplc監(jiān)控反應(yīng)至原料≤1%，反應(yīng)液加入高氯酸鈉丙酮溶液，抽濾，濾餅用丙酮充分洗滌，得到目標(biāo)化合物m7gmp-im。

21、優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑d和有機(jī)溶劑e均選自dmf。

22、本發(fā)明的另一目的是提供所述的含hna結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物在t7?rna聚合酶體系下mrna合成中的應(yīng)用。

23、本發(fā)明的含hna結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物及其制備方法和應(yīng)用，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

24、本發(fā)明將帽子結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，提供了一種含hna結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物及其制備方法，發(fā)現(xiàn)的含hna結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物屬于一種新物質(zhì)，目前尚無(wú)文獻(xiàn)或?qū)＠麍?bào)道，該物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)為mrna系列的研究和新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了平臺(tái)意義，拓寬了mrna研究的范圍。含hna結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物能夠用于t7?rna聚合酶體系下的mrna加帽。

25、與現(xiàn)有帽結(jié)構(gòu)類(lèi)似物clean?cap相比，本發(fā)明的含hna結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物其生產(chǎn)的mrna更低的免疫原性。

技術(shù)特征：

1.一種含hna結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物，其特征在于，該含hna結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物的結(jié)構(gòu)如式i所示：

2.一種如權(quán)利要求1所述的含hna結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物的合成方法，其特征在于，該合成方法包含：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述終止反應(yīng)，加入edta-na溶液終止反應(yīng)。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述純化采用deae柱。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑a選自dmf。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述二核苷酸的合成方法包含：

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的合成方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑b選自二氯甲烷；所述有機(jī)溶劑c選自乙腈。

8.根據(jù)權(quán)利要求2~7中任意一項(xiàng)所述的合成方法，其特征在于，所述中間體m7gmp-im的合成方法包含：

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的合成方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑d和有機(jī)溶劑e均選自dmf。

10.如權(quán)利要求1所述的含hna結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物在t7?rna聚合酶體系下mrna合成中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種含HNA結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物及其制備方法和應(yīng)用，該含HNA結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物的結(jié)構(gòu)如式I所示，式I中，R<subgt;1</subgt;和R<subgt;2</subgt;各自獨(dú)立地選自H、Me、MOE或F；X選自O(shè)、S或Se；Base選自腺嘌呤堿基、鳥(niǎo)嘌呤堿基、胞嘧啶堿基、5?甲基胞嘧啶堿基或尿嘧啶。本發(fā)明將帽子結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)的含HNA結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物屬于一種新物質(zhì)，該物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)為mRNA系列的研究和新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了平臺(tái)意義，拓寬了mRNA研究的范圍。含HNA結(jié)構(gòu)的起始加帽寡核苷酸引物能夠用于T7?RNA聚合酶體系下的mRNA加帽。

技術(shù)研發(fā)人員：耿佩佩,酈雯娟,劉勝韜,劉鵬雷,謝星輝
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上?？茲捎佬郎锟萍加邢薰?br/>技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6