本發(fā)明涉及生物醫(yī)學，具體涉及一種睪丸組織培養(yǎng)基與3d培養(yǎng)方法及其在藥理毒理方向的應用。

背景技術(shù)：

1、在藥物開發(fā)中，評估毒性對男性生殖系統(tǒng)的不利影響至關(guān)重要，通常依賴于體內(nèi)動物實驗，體外細胞實驗和精子實驗。體外實驗具有快速、簡便、經(jīng)濟的優(yōu)點，可以初步對藥物生殖毒性和藥理進行篩查。

2、睪丸組織體外培養(yǎng)通常被用于研究精子發(fā)生調(diào)控機制，選取胚胎期或剛出生的小鼠睪丸組織進行培養(yǎng)直至精子發(fā)生，因睪丸微環(huán)境異常導致生精障礙的患者重建生育力提供了治療的希望，并為青春期前癌癥患者生育力保存的臨床技術(shù)發(fā)展提供了重要參考。目前很少有研究將睪丸組織體外培養(yǎng)技術(shù)運用在男性生殖毒性的研究中。睪丸體外培養(yǎng)系統(tǒng)不僅可以模擬睪丸在體內(nèi)的微環(huán)境，還可在一定范圍內(nèi)替代動物進行藥物篩選和毒性評價，這種方法大大減少了動物的使用和時間，符合動物保護的“3r”原則(減量、替代、優(yōu)化)。因此睪丸組織體外培養(yǎng)系統(tǒng)具有很大的應用潛力，是體外生殖毒性研究的主要發(fā)展方向。傳統(tǒng)的體外實驗基本上是2d培養(yǎng)系統(tǒng)，不能很好地模擬睪丸在體內(nèi)的微環(huán)境，需要開發(fā)更能模擬睪丸在體內(nèi)的微環(huán)境3d培養(yǎng)方法系統(tǒng)，維持睪丸組織的活性和功能，為研究和治療提供有力支持。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種睪丸組織培養(yǎng)基：

2、以含雙抗的dmem低糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加以下成分：胎牛血清（fbs）、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒補充劑、枸杞多糖、睪丸提取液、n-乙酰半胱胺酸(nac)、維生素c、睪酮、表皮生長因子(epidermal?growthfactor,?egf)、堿性成纖維細胞生長因子(basicfibroblast?growth?factor,?bfgf)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1?(transforming?growth?factor-β1,tgf-β1)；

3、所述添加成分使用dmem低糖培養(yǎng)基進行定容后的濃度為：5%?fbs、1x胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒補充劑、100ug/ml?枸杞多糖、10ul/ml?睪丸提取液、10ug/ml?nac、10-3m?維生素c、20um睪酮、50ng/ml?egf、50ng/ml?bfgf和20ng/ml?tgf-β1?。

4、所述睪丸提取液的制備方法：取新鮮成年小鼠睪丸組織剪碎成塊狀放入含生理鹽水的預冷的離心管中，在冰盒中超聲至睪丸組織破碎完全；對超聲得到的混懸液離心取上清液過濾即得睪丸提取液。

5、進一步地，所述睪丸提取液的制備方法：

6、（1）取樣：取新鮮成年小鼠睪丸組織50mg剪碎成塊狀，放入含200?ul生理鹽水的預冷的離心管中。

7、（2）超聲：將裝有睪丸組織的離心管放在冰盒中超聲處理，70hz，運行5s，停止6s，循環(huán)15次，如果沒有破碎完全可增加循環(huán)次數(shù)。

8、（3）離心：對超聲得到的混懸液4°c，14000rpm離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移到新的預冷好的離心管中。

9、（4）過濾：在無菌環(huán)境中用5ml注射器吸取清液，裝上無菌針頭式過濾器進行過濾得到睪丸提取液，即用即制備。

10、一種睪丸組織3d培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

11、s1.睪丸標本采集處理：分離睪丸組織，切成適合組織培養(yǎng)的微小組織塊；

12、s2.睪丸組織塊接種：將s1切好的組織塊接種到含有生物水凝膠的培養(yǎng)板上，加入適量生物水凝膠至完全包裹睪丸組織，孵育至生物水凝膠凝固后，每孔加入適量的以上所述的睪丸組織培養(yǎng)基，進行培養(yǎng)；

13、s3.藥物處理：更換含有測試藥物的以上所述的睪丸組織培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；

14、s4.結(jié)果分析：通過活性檢測和組織形態(tài)觀察，判斷測試藥物對睪丸組織的藥理和毒性。

15、進一步地，所述活性檢測為cck-8測試，根據(jù)培養(yǎng)板各孔的吸光度值進行換算，計算出測試藥物對睪丸組織塊活性的影響。

16、所述組織形態(tài)觀察為根據(jù)he染色切片觀察各組培養(yǎng)后的睪丸組織形態(tài)，根據(jù)tunel染色結(jié)果觀察睪丸組織的凋亡情況，分析測試藥物對睪丸組織塊形態(tài)的影響。

17、優(yōu)選地，所述生物水凝膠為無異源的合成多糖vitrogel水凝膠，為一種無異源的合成多糖水凝膠系統(tǒng)，可以模擬天然的細胞外基質(zhì)(ecm)環(huán)境，也可以用其他生物相容性好的水凝膠代替，比如i型鼠尾膠原蛋白、基質(zhì)膠、納米纖維素水凝膠、海藻酸鈉水凝膠等。

18、所述睪丸組織為小鼠睪丸組織。

19、以上所述的睪丸組織培養(yǎng)基或所述的睪丸組織3d培養(yǎng)方法，在雄性生殖毒理和藥理評估中的應用。

20、本發(fā)明的技術(shù)效果：

21、1.本發(fā)明提供的睪丸組織培養(yǎng)基使用了枸杞多糖能促進睪丸生殖細胞正常發(fā)育并對損傷后的生精細胞染色體具有修復保護作用，睪丸提取液中含有豐富的分子量低于10kda的且不具抗原性的分子肽，與其他成分協(xié)同作用，對于維持睪丸正常功能起到了重要作用，與現(xiàn)有培養(yǎng)基相比，本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)的睪丸組織幾乎沒有死亡細胞，在體外睪丸3d培養(yǎng)中有非常優(yōu)越的效果，保持了睪丸組織的高活性和完整形態(tài)。

22、2.本發(fā)明通過對水凝膠篩選，優(yōu)選使用vitrogel水凝膠來包埋睪丸組織，形成三維空間結(jié)構(gòu)。當放置在培養(yǎng)基中時，周圍的組織培養(yǎng)液會滲透到這種結(jié)構(gòu)中，為睪丸組織提供生存所需的營養(yǎng)物質(zhì)。而且該生物水凝膠在睪丸組織周圍施加一定的壓力，更好地模擬了人體內(nèi)的睪丸微環(huán)境。在一定范圍內(nèi)可替代動物進行藥物篩選和毒性評價，這種方法大大減少了動物的使用和實驗時間，符合動物保護的“3r”原則(減量、替代、優(yōu)化)，具有很大的應用潛力，是體外生殖毒性研究的主要發(fā)展方向。

23、3.本發(fā)明首次使用成年小鼠睪丸將睪丸組織3d培養(yǎng)體系應用在雄性生殖毒理和藥理評估中。

技術(shù)特征：

1.一種睪丸組織培養(yǎng)基，其特征在于：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的睪丸組織培養(yǎng)基，其特征在于：

3.一種睪丸組織3d培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的睪丸組織3d培養(yǎng)方法，其特征在于：所述活性檢測為cck-8測試，根據(jù)培養(yǎng)板各孔的吸光度值進行換算，計算出測試藥物對睪丸組織塊活性的影響。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的睪丸組織3d培養(yǎng)方法，其特征在于：所述組織形態(tài)觀察為根據(jù)he染色切片觀察各組培養(yǎng)后的睪丸組織形態(tài)，根據(jù)tunel染色結(jié)果觀察睪丸組織的凋亡情況，分析測試藥物對睪丸組織塊形態(tài)的影響。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的睪丸組織3d培養(yǎng)方法，其特征在于：所述生物水凝膠為無異源的合成多糖vitrogel水凝膠或i型鼠尾膠原蛋白或基質(zhì)膠或納米纖維素水凝膠或海藻酸鈉水凝膠。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的睪丸組織3d培養(yǎng)方法，其特征在于：所述生物水凝膠為無異源的合成多糖vitrogel水凝膠。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的睪丸組織3d培養(yǎng)方法，其特征在于：所述睪丸組織為小鼠睪丸組織。

9.如權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基或權(quán)利要求3-8任一項所述的培養(yǎng)方法，在雄性生殖毒理和藥理評估中的應用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種睪丸組織培養(yǎng)基與3D培養(yǎng)方法及其應用。本發(fā)明所述睪丸組織培養(yǎng)基以含雙抗的DMEM低糖培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并添加枸杞多糖、睪丸提取液等成分，以生物水凝膠構(gòu)建3D培養(yǎng)體系，不僅可以模擬睪丸在體內(nèi)的微環(huán)境，還可在一定范圍內(nèi)替代動物進行藥物篩選和毒性評價，大大減少了動物的使用和時間，符合動物保護“減量、替代、優(yōu)化”的“3R”原則，具有很大的應用潛力。

技術(shù)研發(fā)人員：羅韜,錢瑞蕊,陳厚仰,何遠橋
受保護的技術(shù)使用者：南昌樂悠生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6