本發(fā)明涉及生物工程，具體涉及一種高效合成重組人源乳鐵蛋白的方法。

背景技術(shù)：

1、乳鐵蛋白，一種含有約700個氨基酸，分子量為80?kda的多功能糖蛋白，物種間同源性較高。其中，人源乳鐵蛋白具有廣泛的生物學(xué)功能，包括抗病毒、抗菌和抗氧化活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長速率，以及參與先天/特異性免疫反應(yīng)，在醫(yī)藥、酶、食品成分、營養(yǎng)添加劑和抗體、工業(yè)、保健、研究和日常生活中具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，天然乳鐵蛋白的產(chǎn)量低，且分離和純化的成本較高，通過基因工程技術(shù)異源生產(chǎn)人源乳鐵蛋白是解決上述問題的理想途徑。目前重組人源乳鐵蛋白已在一系列生物體中表達(dá)，包括酵母、絲狀真菌和高等植物，但表達(dá)效果不理想。開發(fā)高效的人源乳鐵蛋白表達(dá)系統(tǒng)，大規(guī)模生產(chǎn)人源乳鐵蛋白迫在眉睫。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。

2、鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足和實際需求，本發(fā)明還有一個目的是提供一種高效合成重組人源乳鐵蛋白的方法，本發(fā)明通過構(gòu)建得到的重組表達(dá)藻株，合成人源乳鐵蛋白，并通過發(fā)酵優(yōu)化，提高重組藻株的人源乳鐵蛋白合成量。

3、為此，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

4、第一方面，微藻工程株的構(gòu)建方法，包括：向萊茵微藻中至少轉(zhuǎn)化兩次目的基因以構(gòu)建得到微藻工程菌，且每次轉(zhuǎn)入萊茵微藻中的目的基因均成功表達(dá)，所述目的基因為能夠表達(dá)人源乳鐵蛋白的基因。

5、優(yōu)選的是，所述的微藻工程株的構(gòu)建方法中，所述目的基因的核苷酸序列如seqid?no:2所示。

6、第二方面，一株微藻工程株，其采用如下方法構(gòu)建得到：向萊茵微藻中至少轉(zhuǎn)化兩次目的基因以構(gòu)建得到微藻工程菌，且至少兩次轉(zhuǎn)入萊茵微藻中的目的基因均成功表達(dá)，所述目的基因的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

7、第三方面，一種高效合成重組人源乳鐵蛋白的方法，包括如下步驟：

8、1）向萊茵微藻中至少轉(zhuǎn)化兩次目的基因以構(gòu)建得到微藻工程菌，且每次轉(zhuǎn)入萊茵微藻中的目的基因均成功表達(dá)，所述目的基因為能夠表達(dá)人源乳鐵蛋白的基因；

9、2）將所述微藻工程菌接種于液體培養(yǎng)基中于溫度20~30℃下光照培養(yǎng)，收獲藻液，從藻液中獲取到重組人源乳鐵蛋白。

10、優(yōu)選的是，所述的高效合成重組人源乳鐵蛋白的方法中，步驟2）中，所述液體培養(yǎng)基采用液體tap培養(yǎng)基。

11、優(yōu)選的是，所述的高效合成重組人源乳鐵蛋白的方法中，步驟2）中，所述液體培養(yǎng)基中額外添加濃度為0.04~0.4mm的fe2+。

12、優(yōu)選的是，所述的高效合成重組人源乳鐵蛋白的方法中，所述液體培養(yǎng)基包含濃度為8mm的纈氨酸。

13、優(yōu)選的是，所述的高效合成重組人源乳鐵蛋白的方法中，步驟2）中，所述液體培養(yǎng)基中額外添加有濃度為2?~10?g/l的乙酸鈉。

14、優(yōu)選的是，所述的高效合成重組人源乳鐵蛋白的方法中，所述tap液體培養(yǎng)基中額外添加有濃度0.3mm?fe2+、8mm的纈氨酸和6?g/l的乙酸鈉。

15、優(yōu)選的是，所述的高效合成重組人源乳鐵蛋白的方法中，步驟1）中，向萊茵衣藻中至少轉(zhuǎn)化兩次目的基因以構(gòu)建得到微藻工程菌包括如下步驟：

16、將如seq?id?no:2所示的基因序列構(gòu)建到萊茵衣藻表達(dá)載體上，之后利用玻璃珠法將萊茵衣藻表達(dá)載體轉(zhuǎn)入萊茵衣藻中并篩選得到表達(dá)成功的萊茵衣藻藻株hlf6；

17、將如seq?id?no:2所示的基因序列構(gòu)建到另一萊茵衣藻表達(dá)載體上，將該另一萊茵衣藻表達(dá)載體轉(zhuǎn)入萊茵衣藻藻株hlf6中并篩選得到表達(dá)成功的萊茵衣藻藻株hlf6-18。

18、優(yōu)選的是，所述的高效合成重組人源乳鐵蛋白的方法中，如將對數(shù)生長期的萊茵衣藻藻株hlf6-18接種到發(fā)酵罐中。培養(yǎng)基為含有0.04~0.4?mm的fe2+、纈氨酸和2-10?g/l乙酸鈉的液體tap培養(yǎng)基。

19、優(yōu)選的是，所述的高效合成重組人源乳鐵蛋白的方法中，步驟2）中，光照培養(yǎng)時間為5~10天，光照強(qiáng)度為60~100?μmol/(m2·s)。更優(yōu)選地是，光照培養(yǎng)時間為7天，光照強(qiáng)度為80?μmol/(m2·s)。

20、本發(fā)明至少包括以下有益效果：

21、本發(fā)明在萊茵衣藻uvm4中至少轉(zhuǎn)化兩次人源乳鐵蛋白hlf基因，引入人源乳鐵蛋白合成途徑，構(gòu)建得到高表達(dá)量的工程藻株hlf6-18，在此基礎(chǔ)上添加fe2+、纈氨酸和乙酸鈉(作為碳源)，在5?l發(fā)酵放大培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。最終實現(xiàn)人源乳鐵蛋白的最大產(chǎn)量相較于培養(yǎng)條件優(yōu)化前提高約7倍。

22、本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。

技術(shù)特征：

1.微藻工程株的構(gòu)建方法，其特征在于，包括：向萊茵微藻中至少轉(zhuǎn)化兩次目的基因以構(gòu)建得到微藻工程菌，且至少兩次轉(zhuǎn)入萊茵微藻中的目的基因均成功表達(dá)，所述目的基因為能夠表達(dá)人源乳鐵蛋白的基因。

2.如權(quán)利要求1所述的微藻工程株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述目的基因的氨基酸序列如seq?id?no:1所示，核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

3.株微藻工程株，其特征在于，其采用如下方法構(gòu)建得到：向萊茵微藻中至少轉(zhuǎn)化兩次目的基因以構(gòu)建得到微藻工程菌，且至少兩次轉(zhuǎn)入萊茵微藻中的目的基因均成功表達(dá)，所述目的基因的核苷酸序列如seq?id?no:2所示。

4.一種高效合成重組人源乳鐵蛋白的方法，其特征在于，包括如下步驟：

5.如權(quán)利要求4所述的高效合成重組人源乳鐵蛋白的方法，其特征在于，步驟2）中，所述液體培養(yǎng)基采用液體tap培養(yǎng)基。

6.如權(quán)利要求4所述的高效合成重組人源乳鐵蛋白的方法，其特征在于，步驟2）中，所述液體培養(yǎng)基中額外添加濃度為0.04~0.4mm的fe2+。

7.如權(quán)利要求4所述的高效合成重組人源乳鐵蛋白的方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基包含濃度為8mm的纈氨酸。

8.如權(quán)利要求4所述的高效合成重組人源乳鐵蛋白的方法，其特征在于，步驟2）中，所述液體培養(yǎng)基中額外添加有濃度為2?~10?g/l的乙酸鈉。

9.如權(quán)利要求5所述的高效合成重組人源乳鐵蛋白的方法，其特征在于，所述tap液體培養(yǎng)基中額外添加有濃度0.3mm?fe2+、8mm的纈氨酸或6?g/l的乙酸鈉中的任意一種、兩種或三種。

10.如權(quán)利要求4所述的高效合成重組人源乳鐵蛋白的方法，其特征在于，步驟1）中，向萊茵微藻中至少轉(zhuǎn)化兩次目的基因以構(gòu)建得到微藻工程菌包括如下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了高效合成重組人源乳鐵蛋白的方法，包括：向萊茵微藻中至少轉(zhuǎn)化兩次目的基因以構(gòu)建得到微藻工程菌，目的基因為能夠表達(dá)人源乳鐵蛋白的基因；將微藻工程菌接種于液體培養(yǎng)基中于溫度20~30℃下光照培養(yǎng)，收獲藻液，從藻液中獲取到重組人源乳鐵蛋白。本發(fā)明在萊茵衣藻中至少轉(zhuǎn)化兩次人源乳鐵蛋白HLF基因，引入人源乳鐵蛋白合成途徑，構(gòu)建得到高表達(dá)量的工程藻株，在此基礎(chǔ)上調(diào)整培養(yǎng)基配方，在5L發(fā)酵放大條件下培養(yǎng)，最終實現(xiàn)人源乳鐵蛋白的最大產(chǎn)量相較于培養(yǎng)條件優(yōu)化前提高約7倍，達(dá)到細(xì)胞干重的1.1%。

技術(shù)研發(fā)人員：趙磊,侯余勇,路思晗,閆睢豪,劉智永,鄧必成
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6