本發(fā)明涉及單克隆抗體，具體地說，涉及一種cbln1單克隆抗體和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、對于前列腺癌早期患者，臨床上通常用主動監(jiān)測、根治性切除術(shù)并以放射療法進(jìn)行輔助治療，而對于中晚期及轉(zhuǎn)移期的前列腺癌，由于其發(fā)病機理復(fù)雜多樣，至今尚未有最佳的診療方案。靶向ar信號通路的雄激素剝奪療法是臨床治療前列腺癌的一線方案，但患者在接受該治療后，絕大多數(shù)會復(fù)發(fā)成為去勢抵抗性前列腺癌crpc。此外，前列腺癌的免疫抑制性腫瘤微環(huán)境導(dǎo)致免疫檢查點療法在前列腺癌患者中無法取得顯著療效。

2、而對于乳腺癌來說，臨床大多數(shù)抗癌藥物仍是針對腫瘤細(xì)胞本身的靶向療法，但仍有許多患者最終復(fù)發(fā)成為轉(zhuǎn)移性乳腺癌。免疫療法早在1998年就已進(jìn)入乳腺癌患者的臨床實踐，這些藥物改善了早期或晚期乳腺癌患者的總體生存率。然而，經(jīng)過治療后的腫瘤組織通常會出現(xiàn)內(nèi)在或獲得性耐藥機制，最終出現(xiàn)病情進(jìn)展，且后續(xù)無有效治療方案。因此，開發(fā)新型有效的前列腺癌及乳腺癌的靶向治療方法已迫在眉睫。

3、研究表明外周自主神經(jīng)系統(tǒng)在組織生長、穩(wěn)態(tài)維持及器官功能中都有重要作用。由于腫瘤組織同樣需要器官發(fā)育時期的關(guān)鍵調(diào)控信號來維持生長和存活，因此研究認(rèn)為靶向瘤內(nèi)神經(jīng)系統(tǒng)可以有效控制腫瘤進(jìn)展。乳腺和前列腺都是神經(jīng)浸潤豐富的器官，而神經(jīng)系統(tǒng)在乳腺癌腫瘤進(jìn)展中起促進(jìn)作用，阻斷交感神經(jīng)信號能有效抑制腫瘤發(fā)展。自主神經(jīng)系統(tǒng)在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中同樣也發(fā)揮重要作用。尤其需要注意的是，腫瘤組織中浸潤的神經(jīng)密度與疾病惡性程度呈正相關(guān)，與腫瘤組織的psa表達(dá)程度相關(guān)，表明神經(jīng)系統(tǒng)在雄激素受體依賴性crpc前列腺癌以及去勢抵抗性前列腺癌crpc進(jìn)展過程中的潛在作用。神經(jīng)化學(xué)信號傳導(dǎo)是外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮調(diào)控作用的主要方式。除了經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)以外，目前沒有探索神經(jīng)分泌蛋白在前列腺癌及乳腺癌中可能作用及靶向治療的相關(guān)研究。

4、cbln1是小腦顆粒細(xì)胞表達(dá)分泌的高度保守的神經(jīng)分泌蛋白。該蛋白的表達(dá)缺失直接導(dǎo)致生理情況下神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建缺陷。目前市面上的cbln1抗體多數(shù)為多克隆識別抗體，僅能識別cbln1蛋白，不具備體內(nèi)體外靶向阻斷cbln1蛋白功能的效果。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種cbln1單克隆抗體和應(yīng)用。并提供一種cbln1抗體在制備治療乳腺癌、前列腺癌藥物中的用途。

2、本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種cbln1單克隆抗體zh-dt7792，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，

4、zh-dt7792輕鏈可變區(qū)的三個互補決定區(qū)分別為：

5、cdr1：qslvhs?ngnty（seq?id?no.1）

6、cdr2：kvs

7、cdr3：sqnthvpwt（seq?id?no.2）

8、zh-dt7792重鏈可變區(qū)的三個互補決定區(qū)分別為：

9、cdr1：gfnikdyf（seq?id?no.3）

10、cdr2：idpangnt（seq?id?no.4）

11、cdr3：nafhyghygrgyavdy（seq?id?no.5）。

12、作為本發(fā)明的一些具體實施方式，所述cbln1單克隆抗體zh-dt7792的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.6所示；

13、和/或，所述cbln1單克隆抗體zh-dt7792的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?idno.7所示。

14、第二方面，本發(fā)明提供一種cbln1單克隆抗體zh-dt7792的制備方法，所述cbln1單克隆抗體由cbln1重組蛋白作為免疫原進(jìn)行免疫獲得；所述cbln1重組蛋白是以人cbln1蛋白全長序列為目標(biāo)序列，通過添加信號肽和c-his標(biāo)簽，以hek293/cho為表達(dá)宿主細(xì)胞，通過密碼子優(yōu)化與基因合成，表達(dá)與純化后獲得的。

15、作為本發(fā)明的一些具體實施方式，所述人cbln1蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.8所示，所述信號肽的氨基酸序列如seq?id?no.9所示，所述c-his標(biāo)簽的氨基酸序列如seqid?no.10所示。

16、作為本發(fā)明的一些具體實施方式，所述cbln1重組蛋白的氨基酸序列如seq?idno.11所示；所述cbln1重組蛋白經(jīng)密碼子優(yōu)化后的基因序列如seq?id?no.12所示。

17、作為本發(fā)明的一些具體實施方式，所述cbln1單克隆抗體zh-dt7792的制備方法具體包括如下步驟：

18、步驟一、選取balb/c小鼠作為免疫對象，以cbln1重組蛋白為免疫原，多輪免疫后，采集小鼠微量血液通過間接elisa確定血清效價；當(dāng)血清效價達(dá)到b細(xì)胞分許標(biāo)準(zhǔn)后，取一定量的免疫原對小鼠作最后一次沖擊免疫；

19、步驟二、收集目的小鼠外周血分選記憶b細(xì)胞，通過單細(xì)胞基因擴(kuò)增技術(shù)獲取抗體重輕鏈基因片段并構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，瞬時表達(dá)后收集上清，利用間接elisa檢測陽性細(xì)胞上清；

20、步驟三、對陽性細(xì)胞上清對應(yīng)的抗體重輕鏈質(zhì)粒進(jìn)行測序，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒及瞬轉(zhuǎn)表達(dá)后，收集并純化即獲得cbln1重組蛋白特異單克隆抗體zh-dt7792。

21、第三方面，本發(fā)明提供了一種神經(jīng)小腦肽cbln1單克隆抗體zh-dt7792在制備治療乳腺癌藥物中的應(yīng)用。

22、發(fā)明人發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞系4t1能夠誘使腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞表達(dá)cbln1受體nrxn1，通過對4t1乳腺癌荷瘤小鼠腹腔注射cbln1單克隆抗體，分析腫瘤大小及質(zhì)量，明確cbln1單克隆抗體在乳腺癌治療中的可能用途。

23、第四方面，本發(fā)明提供了一種神經(jīng)小腦肽cbln1特異性單克隆抗體zh-dt7792在制備治療前列腺癌藥物中的應(yīng)用。

24、作為本發(fā)明的一些具體實施方式，所述前列腺癌包括去勢抵抗性前列腺癌。通過對probasin-cre;trp53f/f;?ptenf/f去勢抵抗性前列腺癌荷瘤小鼠腹腔注射cbln1單克隆抗體，分析腫瘤大小及質(zhì)量，明確cbln1單克隆抗體在去勢抵抗性前列腺癌治療中的可能用途。

25、作為本發(fā)明的一些具體實施方式，所述前列腺癌包括雄激素受體依賴性前列腺癌。通過對probasin-cre;ptenf/f;?mychi雄激素受體依賴性前列腺癌荷瘤小鼠腹腔注射cbln1單克隆抗體，分析腫瘤大小及質(zhì)量，明確cbln1單克隆抗體在雄激素受體依賴性前列腺癌治療中的可能用途。

26、本發(fā)明提供了一種cbln1單克隆抗體zh-dt7792在緩解前列腺癌免疫微環(huán)境抑制性中的應(yīng)用。通過對probasin-cre;ptenf/f;?mychi原位前列腺癌荷瘤小鼠腹腔注射cbln1單克隆抗體，分析免疫微環(huán)境中主要免疫細(xì)胞組成，明確cbln1單克隆抗體在緩解前列腺癌免疫微環(huán)境抑制性中的可能用途。

27、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

28、1）本發(fā)明的cbln1重組蛋白作為免疫原能夠成功免疫balb/c小鼠并獲得cbln1單克隆抗體zh-dt7792，具有特異性識別神經(jīng)小腦肽cbln1的效果；

29、2）本發(fā)明的cbln1單克隆抗體zh-dt7792能夠用于制備治療乳腺癌的藥物；

30、3）本發(fā)明的cbln1特異單克隆抗體zh-dt7792，具有在前列腺癌中功能性阻斷cbln1的效果，具有緩解前列腺癌腫瘤微環(huán)境免疫抑制性的效果；且能夠用于制備治療去勢抵抗性前列腺癌和雄激素受體依賴性前列腺癌的藥物。