本發(fā)明涉及腫瘤免疫治療領(lǐng)域，特別是涉及一種基于樹突狀細(xì)胞(dc)和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cik)共培養(yǎng)體系的制備方法，以及通過致敏抗原增強(qiáng)細(xì)胞的特異性抗腫瘤活性的方法。

背景技術(shù)：

1、dc-cik共培養(yǎng)細(xì)胞是一種結(jié)合樹突狀細(xì)胞(dendritic?cells,dc)和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced?killer?cells,cik)的免疫細(xì)胞療法。這種方法旨在增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)，通常用于腫瘤免疫治療研究。

2、dc細(xì)胞是強(qiáng)大的抗原呈遞細(xì)胞，能夠有效地捕捉、處理和呈遞抗原給t細(xì)胞，從而啟動和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。在dc-cik共培養(yǎng)系統(tǒng)中，dc細(xì)胞首先通過外源抗原(例如腫瘤細(xì)胞裂解物或特異性腫瘤抗原)的致敏處理，使其能夠有效識別并呈遞腫瘤相關(guān)抗原。cik細(xì)胞是一類異質(zhì)性細(xì)胞群體，主要由cd3+、cd56+的細(xì)胞亞群組成，具有高效的抗腫瘤活性。cik細(xì)胞的特點(diǎn)是具有天然殺傷細(xì)胞和t細(xì)胞的雙重特性，因而在抗腫瘤免疫應(yīng)答中表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。

3、在dc-cik共培養(yǎng)過程中，首先通過體外培養(yǎng)獲得成熟的dc細(xì)胞和活性化的cik細(xì)胞。然后，將致敏的dc細(xì)胞與cik細(xì)胞共同培養(yǎng)，以使cik細(xì)胞通過dc細(xì)胞的抗原呈遞功能進(jìn)一步激活。這種共培養(yǎng)策略能夠顯著增強(qiáng)cik細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷能力。

4、dc-cik細(xì)胞聯(lián)合治療能夠顯著提高抗腫瘤療效，具有較好的免疫學(xué)持久性和廣泛的應(yīng)用前景。研究表明，這種治療方法在多種實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。dc-cik細(xì)胞療法在增強(qiáng)免疫系統(tǒng)識別和清除腫瘤細(xì)胞方面展現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢，成為個性化腫瘤免疫治療中的重要策略之一。

5、dc-cik細(xì)胞治療在腫瘤免疫治療中展現(xiàn)出巨大的潛力。然而，傳統(tǒng)的dc-cik共培養(yǎng)體系仍存在一定的局限性，例如dc細(xì)胞的抗原呈遞效率有限，cik細(xì)胞的增殖能力和特異性殺傷活性不夠理想。因此，如何進(jìn)一步優(yōu)化dc-cik共培養(yǎng)體系，提高其治療效果，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種dc-cik共培養(yǎng)細(xì)胞的制備方法及其致敏抗原和應(yīng)用。

2、因此，本發(fā)明一方面公開了一種dc-cik共培養(yǎng)細(xì)胞的制備方法，所述方法包括以下步驟：

3、(1)pbmcs的分離：通過ficoll-paque溶液從血液中分離獲得pbmcs；

4、(2)dc細(xì)胞的制備：將分離獲得的pbmcs以1×106個/ml的密度接種到含10％fbs、1000iu/ml?gm-csf和500iu/ml?il-4的rpmi-1640培養(yǎng)基中，隨后加入抗ctla-4單克隆抗體和afp蛋白促使dc成熟；

5、(3)cik細(xì)胞的制備：將pbmcs以1×106個/ml的密度接種到含10％fbs、1000u/ml的ifn-γ的rpmi-1640培養(yǎng)基中，隨后更換含10％fbs、1000u/ml的il-2和終濃度為50ng/ml的抗cd3單克隆抗體以誘導(dǎo)cik細(xì)胞生成；

6、(4)dc-cik細(xì)胞的共培養(yǎng)：將成熟的dc細(xì)胞與cik細(xì)胞按比例均勻接種于三維支架表面，將接種好的支架置于動態(tài)培養(yǎng)裝置中，流速設(shè)置為0.5ml/min，在37℃、5％co2的培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)48～72小時(shí)獲得dc-cik細(xì)胞。

7、優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟(2)dc細(xì)胞的制備中的抗ctla-4單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示。

8、優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟(2)dc細(xì)胞的制備中的抗ctla-4單克隆抗體和afp蛋白的使用濃度分別為10μg/ml和5μg/ml。

9、優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟(3)cik細(xì)胞的制備中的抗cd3單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列分別如seq?id?no:3和seq?id?no:4所示。

10、優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟(4)dc-cik細(xì)胞的共培養(yǎng)中的dc細(xì)胞與cik細(xì)胞的比例為1:5。

11、優(yōu)選地，本發(fā)明所述步驟(4)dc-cik細(xì)胞的共培養(yǎng)中的三維支架孔徑為200-250μm，孔隙率約為90％。

12、再一方面，本發(fā)明還公開了一種制備的dc-cik共培養(yǎng)細(xì)胞在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

13、本發(fā)明采用了兩種致敏抗原的聯(lián)合應(yīng)用，用于激活dc細(xì)胞的抗原呈遞功能，同時(shí)通過調(diào)控免疫微環(huán)境，進(jìn)一步增強(qiáng)cik細(xì)胞的增殖和活化狀態(tài)。另外，本發(fā)明引入了一種三維動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)。通過在三維支架中進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng)，并在動態(tài)流動培養(yǎng)環(huán)境中增強(qiáng)細(xì)胞間的信號傳遞，提高dc細(xì)胞的抗原呈遞能力和cik細(xì)胞的活性。

14、本發(fā)明提出的創(chuàng)新性的dc-cik共培養(yǎng)細(xì)胞的制備方法，結(jié)合特異性致敏抗原的應(yīng)用，顯著提高了dc細(xì)胞的抗原呈遞能力和cik細(xì)胞的殺傷活性。該方法具有明顯的創(chuàng)造性，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件和創(chuàng)新性抗原的使用，展現(xiàn)出優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的顯著效果。為dc-cik共培養(yǎng)的研究和應(yīng)用提供了良好的參考。

15、需要特別說明的是，本研究制備的抗ctla-4單克隆抗體和抗cd3單克隆抗體均采用常規(guī)的小鼠雜交瘤細(xì)胞技術(shù)篩選、制備和鑒定的。

技術(shù)特征：

1.一種dc-cik共培養(yǎng)細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)dc細(xì)胞的制備中的抗ctla-4單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)dc細(xì)胞的制備中的抗ctla-4單克隆抗體和afp蛋白的使用濃度分別為10μg/ml和5μg/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)cik細(xì)胞的制備中的抗cd3單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列分別如seq?id?no:3和seq?id?no:4所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)dc-cik細(xì)胞的共培養(yǎng)中的dc細(xì)胞與cik細(xì)胞的比例為1:5。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)dc-cik細(xì)胞的共培養(yǎng)中的三維支架孔徑為200-250μm，孔隙率約為90％。

7.一種權(quán)利要求1制備的dc-cik共培養(yǎng)細(xì)胞在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種基于樹突狀細(xì)胞(DC)和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)的共培養(yǎng)體系及其應(yīng)用。該方法通過兩種致敏抗原的聯(lián)合應(yīng)用致敏DC細(xì)胞，并將其與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)，顯著增強(qiáng)了細(xì)胞的特異性抗腫瘤活性。此外，通過引入三維動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)，有效提升了DC細(xì)胞的抗原呈遞能力和CIK細(xì)胞的殺傷活性。本發(fā)明在提高腫瘤免疫治療的效果方面具有顯著優(yōu)勢，可廣泛應(yīng)用于多種實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療。

技術(shù)研發(fā)人員：杜全中,李風(fēng)潮
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣東恒默生物醫(yī)藥科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/28