本申請涉及生物，具體涉及一種2-羥基酸的高通量檢測方法及其應用，進一步涉及一種2-羥基-4-甲硫基丁酸的高通量檢測方法及一種生產(chǎn)蛋氨酸的蛋白酶的高通量快速篩選方法。

背景技術：

1、蛋氨酸，又名甲硫氨酸、2-氨基-4-甲硫基-丁酸，是一種必需氨基酸，對于人體的生長發(fā)育和健康具有重要作用，被廣泛用于醫(yī)藥、食品和化妝品等多個行業(yè)。同時，蛋氨酸也是動物飼料里必不可少的添加劑，可用來提高家禽的瘦肉量與縮短飼養(yǎng)周期。目前用于飼料的市售蛋氨酸主要分為蛋氨酸與羥基蛋氨酸（又稱為“2-羥基-4-甲硫基丁酸”、“液體蛋氨酸”），兩者在生物體內具有同樣的生理功能。近年來全球范圍內對蛋氨酸的需求量逐年增長，而我國的蛋氨酸產(chǎn)量無法滿足飼料行業(yè)快速發(fā)展的需求，因此主要依賴于從海外進口。

2、目前，蛋氨酸的生產(chǎn)方法主要是化學合成法與發(fā)酵法，由于發(fā)酵法產(chǎn)量較低，因此全球的蛋氨酸生產(chǎn)廠家普遍采用化學合成法?；瘜W合成法又可分為海因法與氰醇法，其中海因法可用來合成蛋氨酸，工藝技術較為成熟，但生產(chǎn)過程會存在大量硫酸鈉等副產(chǎn)物，且技術與設備復雜、能耗大；氰醇法工藝路線短，但生產(chǎn)過程中同樣存在氰化氫等劇毒物質，對設備安全性要求高，以及產(chǎn)生三廢問題。生物法合成蛋氨酸仍處在初期階段，需要大量實驗進行改造，如蛋白工程大量篩選突變體文庫等，而2-羥基-4-甲硫基丁酸是生物工程改造高產(chǎn)蛋氨酸過程中的主要產(chǎn)物。目前，檢測2-羥基-4-甲硫基丁酸含量主要采用hplc法，每個樣品檢測時間在40分鐘左右，極大地限制了研發(fā)效率，因此，形成一套成本低廉的2-羥基甲硫丁酸高通量快速檢測方法顯得十分迫切。

技術實現(xiàn)思路

1、基于此，有必要提供一種2-羥基酸的高通量檢測方法及其應用，進一步提供一種2-羥基-4-甲硫基丁酸（以下簡稱為2-羥基甲硫丁酸）的高通量檢測方法及一種生產(chǎn)蛋氨酸的蛋白酶的高通量快速篩選方法。

2、本申請的第一方面提供一種2-羥基酸的高通量檢測方法，包括以下步驟：

3、將待測樣品與顯色試劑混合，獲得顯色體系，進行顯色反應，檢測顯色體系的吸光度以獲得所述待測樣品中2-羥基酸的含量；

4、其中，所述顯色試劑包括：氧化酶、過氧化物酶和abts，以投料量計，所述abts、所述過氧化物酶和所述氧化酶的用量比為（38~42）mm:（15~20）u:（28~32）u。

5、在一些實施方式中，所述氧化酶選自avlox、lcto、aox2和sogo中的一種或多種。

6、在一些實施方式中，所述avlox、lcto、aox2和sogo分別具有如seq?id?no:?1-4所示的氨基酸序列。

7、在一些實施方式中，所述待測樣品與所述顯色試劑的體積比為1:（0.95~1.05）。

8、在一些實施方式中，相對于所述待測樣品體積，所述氧化酶的含量為0.4?u~1.2u，以每100μl待測樣品計。

9、在一些實施方式中，所述待測樣品為含有2-羥基酸的液態(tài)樣品，其中2-羥基酸在所述待測樣品中的濃度為0.3mm~1.0mm。

10、在一些實施方式中，所述待測樣品可用緩沖液進行稀釋以獲得所需的2-羥基酸濃度，其中，所述緩沖液為m9緩沖液，所述m9緩沖液包括na2hpo4、kh2po4、nacl、nh4cl、mgso4和cacl2；可選地，在所述m9緩沖液中，na2hpo4的濃度為6.7?g/l~6.9?g/l，kh2po4的濃度為2.9g/l~3.1?g/l，nacl的濃度為0.4?g/l~0.6?g/l，nh4cl的濃度為0.9?g/l~1.1?g/l，mgso4的濃度為1.9?mm~2.1?mm，cacl2的濃度為2.4?mm~2.6?mm。

11、在一些實施方式中，所述檢測顯色體系的吸光度以獲得所述待測樣品中2-羥基酸的含量的步驟包括：

12、檢測顯色體系的吸光度的線性區(qū)間平均值，利用吸光度的線性區(qū)間平均值與2-羥基酸濃度的標準曲線計算得到所述待測樣品中2-羥基酸的含量；其中，所述的標準曲線的r2值大于或等于0.99。

13、在一些實施方式中，所述檢測顯色體系的吸光度的線性區(qū)間平均值的步驟包括：

14、組成顯色體系后，每30s~60s檢測顯色體系的420nm吸光值，持續(xù)10min~30min；可選地，檢測溫度為25℃~40℃。

15、在一些實施方式中，所述2-羥基酸包括2-羥基-4-甲硫基丁酸、乙醇酸、乳酸、蘋果酸和2-羥基丁酸中的一種或多種。

16、本申請的第二方面提供了一種生產(chǎn)蛋氨酸的蛋白酶的高通量篩選方法，包括如下步驟：

17、在多個不同的蛋白酶作用下生產(chǎn)蛋氨酸，采用本申請第一方面所述的2-羥基酸的高通量檢測方法，同時對多個中間產(chǎn)物中的2-羥基酸的含量進行檢測，根據(jù)2-羥基酸的含量高低評估所述多個不同的蛋白酶對蛋氨酸生產(chǎn)的催化能力強弱，從而高通量篩選出催化能力強的蛋白酶；

18、其中，所述2-羥基酸為2-羥基-4-甲硫基丁酸，

19、其中，所述中間產(chǎn)物包括生產(chǎn)蛋氨酸的發(fā)酵液經(jīng)固體除雜后的上清液。

20、在一些實施方式中，所述中間產(chǎn)物還包括副產(chǎn)物甲硫基丙醛、甲硫基丙酸和甲硫基丙醇中的一種或多種。

21、在一些實施方式中，同時對多個中間產(chǎn)物中的2-羥基酸的含量進行檢測的步驟包括：將中間產(chǎn)物放置在酶標板，使用酶標儀進行檢測，優(yōu)選地，酶標板為96孔酶標板。

22、利用前述的方法可以實現(xiàn)2-羥基酸的高通量檢測，通過氧化酶對2-羥基酸的氧化反應，并用abts法對產(chǎn)生的過氧化氫進行檢測獲得體系中2-羥基酸的含量，該檢測方法準確度高、所需時間短、效率高、且成本低。

23、進一步地，通過該檢測方法可以高通量篩選出催化能力強的生產(chǎn)蛋氨酸的蛋白酶，提高蛋氨酸的產(chǎn)量。

技術特征：

1.一種2-羥基酸的高通量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述氧化酶選自avlox、lcto、aox2和sogo中的一種或多種。

3.如權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述avlox、lcto、aox2和sogo分別具有如seq?id?no:?1-4所示的氨基酸序列。

4.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述待測樣品與所述顯色試劑的體積比為1:（0.95~1.05）。

5.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，相對于所述待測樣品體積，所述氧化酶的含量為0.4?u~1.2?u，以每100μl待測樣品計。

6.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述待測樣品為含有2-羥基酸的液態(tài)樣品，其中2-羥基酸在所述待測樣品中的濃度為0.3mm~1.0mm。

7.如權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述待測樣品可用緩沖液進行稀釋以獲得所需的2-羥基酸濃度，其中，所述緩沖液為m9緩沖液，所述m9緩沖液包括na2hpo4、kh2po4、nacl、nh4cl、mgso4和cacl2；

8.如權利要求1~7中任一項所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測顯色體系的吸光度以獲得所述待測樣品中2-羥基酸的含量的步驟包括：

9.如權利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測顯色體系的吸光度的線性區(qū)間平均值的步驟包括：

10.如權利要求1~9任一項所述的檢測方法，其特征在于，所述2-羥基酸包括2-羥基-4-甲硫基丁酸、乙醇酸、乳酸、蘋果酸和2-羥基丁酸中的一種或多種。

11.一種生產(chǎn)蛋氨酸的蛋白酶的高通量篩選方法，其特征在于，包括如下步驟：

12.如權利要求11所述的生產(chǎn)蛋氨酸的蛋白酶的高通量篩選方法，其特征在于，所述中間產(chǎn)物還包括副產(chǎn)物甲硫基丙醛、甲硫基丙酸和甲硫基丙醇中的一種或多種。

13.如權利要求12所述的生產(chǎn)蛋氨酸的蛋白酶的高通量篩選方法，其特征在于，同時對多個中間產(chǎn)物中的2-羥基酸的含量進行檢測的步驟包括：將中間產(chǎn)物放置在酶標板，使用酶標儀進行檢測，優(yōu)選地，酶標板為96孔酶標板。

技術總結
本申請公開了一種2?羥基酸的高通量檢測方法及其應用。具體公開了一種2?羥基?4?甲硫基丁酸的高通量檢測方法及一種生產(chǎn)蛋氨酸的蛋白酶的高通量快速篩選方法。該檢測方法包括將待測樣品與氧化酶、過氧化氫酶、ABTS混合進行顯色反應，檢測顯色體系的吸光度以獲得所述待測樣品中2?羥基酸的含量。該檢測方法高效便捷且成本較低，相比HPLC檢測方法效率更高。

技術研發(fā)人員：金子靖,藺皓月
受保護的技術使用者：摩珈（上海）生物科技有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/28