本發(fā)明植物分子生物學(xué)，具體公開(kāi)了免疫調(diào)控蛋白gmnfr5a及其植物抗病中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、植物病害是全球面臨的嚴(yán)峻問(wèn)題，對(duì)糧食安全以及產(chǎn)量造成重要威脅。其中卵菌引起的作物病害每年給我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，由疫霉菌引起的大豆疫霉?。? phytophthora?sojae）在田間發(fā)病速度快、范圍廣、變異快，對(duì)大豆產(chǎn)量及質(zhì)量危害嚴(yán)重。目前，生產(chǎn)上對(duì)作物病害的防治以化學(xué)藥劑及培育抗病品種為主。但是，化學(xué)藥劑的大量使用不僅引起病蟲(chóng)抗藥性的產(chǎn)生，還對(duì)環(huán)境和人類健康造成巨大的危害。而抗病品種由于植物遺傳抗病性狀與其他農(nóng)藝性狀難以有機(jī)結(jié)合，采用傳統(tǒng)的農(nóng)藝栽培措施進(jìn)行病害防治的效果十分有限。近年來(lái)，植物誘導(dǎo)抗病性被認(rèn)為是植物保護(hù)的新技術(shù)與新途徑。植物誘導(dǎo)抗病性是指植物在激發(fā)子作用下刺激植物產(chǎn)生抗逆物質(zhì)（植保素、抗菌蛋白等），從而增強(qiáng)植物對(duì)外界逆境的抵抗能力，又稱獲得性免疫。通過(guò)激發(fā)子誘導(dǎo)，可以降低逆境脅迫對(duì)植物造成的損傷，修復(fù)部分生理功能。因此，利用植物自身的抗性基因來(lái)抵御病原菌的入侵，從農(nóng)藥使用、環(huán)境保護(hù)以及抗藥性等方面都顯得尤為重要。

2、同時(shí)，植物為了抵御病原菌入侵，可以通過(guò)識(shí)別環(huán)境中的病原菌細(xì)胞膜表面的模式識(shí)別受體（pattern?recognition?receptor,?prrs）和胞內(nèi)免疫識(shí)別受體（nucleotide-binding?domain?and?leucine-rich-repeat?proteins,?nlrs）以啟動(dòng)免疫機(jī)制。病原菌來(lái)源的mamps能夠被受體激酶（rlks）或受體蛋白（rlps）所識(shí)別，根據(jù)他們的胞外域不同又可分為lrr類、lysm類、lectin類及egf類(macho?&?zipfel,?2014)，其中l(wèi)ysm類主要結(jié)合糖類pamps，參與植物與微生物的免疫過(guò)程。

3、幾丁質(zhì)（chitin）是真菌細(xì)胞壁的主要成分，又名殼多糖或甲殼質(zhì)，是由β-1，4-n-乙?；?d-葡萄糖胺聚合而成的多糖。植物能通過(guò)分泌的幾丁質(zhì)酶裂解幾丁質(zhì)產(chǎn)生幾丁寡糖，幾丁寡糖具有較低的分子量，通過(guò)較好的水溶性誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性。在之前的研究中得知，水稻中的oscebip識(shí)別幾丁寡糖并與oscerk1形成“三明治”結(jié)構(gòu)，由oscerk1向細(xì)胞內(nèi)傳遞免疫信號(hào)；在擬南芥中，atlyk5磷酸化調(diào)控atcrek1并識(shí)別幾丁寡糖，介導(dǎo)免疫反應(yīng)，同時(shí)幾丁寡糖誘導(dǎo)兩個(gè)rlks蛋白互作。病原菌能夠分泌幾丁質(zhì)脫乙?；该附鈳锥」烟堑囊阴；鶊F(tuán)，產(chǎn)生殼寡糖，從而減弱幾丁寡糖誘導(dǎo)的免疫。殼寡糖作為重要的植物免疫激活劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛的應(yīng)用。但是，殼寡糖誘導(dǎo)植物免疫信號(hào)仍不清楚。因此，研究植物中殼寡糖的免疫信號(hào)通路，更好的解釋殼寡糖激發(fā)子誘導(dǎo)的免疫機(jī)制，并對(duì)未來(lái)植物誘抗免疫劑的發(fā)展提供了新的方向。

4、因此，利用和改造植物免疫調(diào)控元件，是植物病害持久安全防控的新途徑，更符合當(dāng)今農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展和可持續(xù)發(fā)展的要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了免疫調(diào)控蛋白gmnfr5a及其植物抗病中的應(yīng)用。

2、一方面，本發(fā)明提供了免疫調(diào)控基因 gmnfr5a，所述免疫調(diào)控基因 gmnfr5a的核苷酸序列為以下任一所示，

3、1）如seq?id?no.1所示的核苷酸序列及其互補(bǔ)序列；或

4、2）如seq?id?no.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸，表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或

5、3）在嚴(yán)格條件下與seq?id?no.1所示序列雜交的核苷酸序列；或

6、4）與seq?id?no.1所示的核苷酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的序列，其編碼的多肽具有提高植物抗病性的功能。

7、另一方面，本發(fā)明提供了免疫調(diào)控基因 gmnfr5a編碼的多肽，所述多肽的氨基酸序列為以下任一所示，

8、1）如seq?id?no.2所示的氨基酸序列；或

9、2)與seq?id?no.2所示的氨基酸序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列，所述多肽具有提高植物抗病性的功能；或

10、3)在seq?id?no.2所示的序列中取代和/或缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基所得的氨基酸序列且氨基酸序列具有調(diào)控植物抗病性的功能。

11、另一方面，本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)載體，所述重組載體包括所述的免疫調(diào)控基因 gmnfr5a。

12、該表達(dá)載體優(yōu)選為植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，可以是如pbin::egfp、pcambia或ptf101.1等多種形式。更優(yōu)選的，該重組表達(dá)載體是將基因 gmnfr5a插入到含有c-端egfp的雙元載體pbin::egfp的酶切位點(diǎn)smai中，最終得到載體pbin::gmnfr5a-egfp。

13、另一方面，本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，包含所述的免疫調(diào)控基因 gmnfr5a，或包含所述的重組載體。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌或農(nóng)桿菌細(xì)胞。

14、另一方面，本發(fā)明還提供了所述的免疫調(diào)控基因 gmnfr5a、或所述的多肽、或所述的重組表達(dá)載體、或所述的宿主細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為以下任一，

15、1）提高或降低植物的免疫誘導(dǎo)抗病能力；

16、2）增強(qiáng)或減弱植物識(shí)別病原菌分泌的殼寡糖或幾丁寡糖的能力；

17、3）篩選抗病/感病植物品種。

18、進(jìn)一步地，所述抗病或所述感病的致病菌包括但不限于煙草疫霉、大豆疫霉、致病疫霉和辣椒疫霉。

19、進(jìn)一步地，所述植物為茄科植物或豆科植物，優(yōu)選為煙草、番茄、馬鈴薯或大豆。

20、本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)而言，分析了大豆中細(xì)胞膜蛋白的功能，發(fā)現(xiàn)免疫調(diào)控蛋白gmnfr5a在識(shí)別疫霉菌或真菌分泌的殼寡糖或幾丁寡糖中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這些激發(fā)子在植物中誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中起決定性作用。同時(shí)，激發(fā)子在不同的疫霉菌或真菌中是保守的，因此gmnfr5a具備識(shí)別不同疫霉菌和真菌的能力。此外，本發(fā)明所述基因 gmnfr5a編碼的蛋白質(zhì)通過(guò)調(diào)控病原菌分泌的激發(fā)子激活植物先天免疫，從而增強(qiáng)植物抗病性。在大豆上沉默 gmnfr5a基因不會(huì)影響植物生長(zhǎng)性狀，但是顯著減弱大豆對(duì)疫霉菌的抗病性。本發(fā)明可以運(yùn)用在作物育種抗病性改良方面，提高植物對(duì)疫病的抗病性。