本發(fā)明涉及核苷或修飾核苷酸鹽，具體為核苷三磷酸或脫氧核苷三磷酸及其修飾性核苷的四丁基銨鹽。

背景技術(shù)：

1、修飾核苷酸或特殊鹽型可用于下游生物酶反應(yīng)體系，核苷或脫氧核苷三磷酸四丁基銨鹽可用于ivd領(lǐng)域pcr、mngs測序、高度擴(kuò)增的高通量測序、lamp、多重?cái)U(kuò)增等。但是核苷或脫氧核苷三磷酸四丁基銨鹽價(jià)格較高，尤其是dttp四丁基銨鹽是一種較為昂貴的化合物，因此其應(yīng)用受到一定的限制，另外由于制備過程較為復(fù)雜，需要嚴(yán)格控制反應(yīng)條件和純化過程，以確保其純度和質(zhì)量。因此dttp四丁基銨鹽在研究階段需要特定的工藝進(jìn)行制備、脫鹽，嚴(yán)格控制產(chǎn)品質(zhì)量。

2、修飾核苷酸或特殊鹽型在小試階段需要產(chǎn)品量較小，一般在毫克級，這就導(dǎo)致修飾核苷酸產(chǎn)品在轉(zhuǎn)鹽和脫鹽方面較難操作。核苷酸類單體產(chǎn)品由于水溶性好和極性很大，導(dǎo)致打漿或析晶很難完全除掉原有鹽型從而獲得新鹽型的離子化合物。修飾核苷酸單體分子量較小，一般在500da左右，導(dǎo)致核酸或蛋白類常用的膜包或中空纖維轉(zhuǎn)鹽較難實(shí)現(xiàn)換液和脫鹽。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決核苷或脫氧核苷及其修飾核苷三磷酸四丁基銨鹽生產(chǎn)的成本高、轉(zhuǎn)鹽和脫鹽難操作的技術(shù)問題。本發(fā)明的目的是提供一種快速、易操作的核苷三磷酸四丁基銨鹽及其制備方法，該方法適合價(jià)值昂貴的修飾核苷酸或脫氧核苷酸的制備，能夠?qū)⑻幚順悠房刂圃诤量思?，又有較高的收率。

2、本發(fā)明第一方面提供一種核苷三磷酸四丁基銨鹽，以核苷三磷酸鹽和四丁基氫氧化銨為原料反應(yīng)制得；所述核苷三磷酸鹽包括核糖核苷三磷酸鹽、脫氧核糖核苷三磷酸鹽、修飾性核糖核苷三磷酸鹽、修飾性脫氧核糖核苷三磷酸鹽。

3、在一種具體實(shí)施方式中，所述原料核苷三磷酸鹽為核苷三磷酸鈉，和或；

4、核苷三磷酸鹽包括脫氧胸苷三磷酸（dttp）、脫氧腺苷三磷酸（datp）、脫氧鳥苷三磷酸（dgtp）、脫氧胞苷三磷酸（dctp）、腺苷三磷酸（atp）、鳥苷三磷酸（gtp）、胞苷三磷酸（ctp）、尿苷三磷酸（utp）中的一種或多種鈉鹽。

5、本發(fā)明第二方面提供上述核苷三磷酸四丁基銨鹽的制備方法，陰離子交換柱為制備柱，以核苷三磷酸鹽為樣品上樣，四丁基氫氧化銨水溶液為流動(dòng)相a，四丁基氯化銨水溶液為流動(dòng)相b，洗脫得到含核苷三磷酸四丁基銨鹽的洗脫液；所述核苷三磷酸鹽包括核糖核苷三磷酸鹽、脫氧核糖核苷三磷酸鹽、修飾性核糖核苷三磷酸鹽、修飾性脫氧核糖核苷三磷酸鹽。

6、在一種具體實(shí)施方式中，所述流動(dòng)相a為濃度5-15mm四丁基氫氧化銨水溶液，例如5mm、7mm、10mm、12mm、15mm；優(yōu)選為10mm。

7、在一種具體實(shí)施方式中，所述流動(dòng)相b為濃度0.5-2m的四丁基氯化銨，例如0.5m、0.8m、1.0m、1.2m、1.5m、1.8m、2m；優(yōu)選0.8-1.8m。流動(dòng)相b的濃度對于產(chǎn)品的制備非常關(guān)鍵，濃度過小，例如小于0.5m時(shí)，會導(dǎo)致產(chǎn)品不能洗脫下來，圖譜中檢測不到目標(biāo)峰；流動(dòng)相濃度過大，例如大于2m時(shí)，則鹽的濃度高，運(yùn)行壓力大，對制備的設(shè)備材質(zhì)要求較高，生產(chǎn)成本也會相應(yīng)增加。

8、在一種具體實(shí)施方式中，所述核苷三磷酸鹽的上樣的樣品重量為陰離子交換柱填料重量的1：（10-100）。例如為1：10、1：20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80、1：90、1：100。優(yōu)選為1：（30-100）。

9、在一種具體實(shí)施方式中，核苷三磷酸鹽包括但不限于脫氧胸苷三磷酸（dttp）、脫氧腺苷三磷酸（datp）、脫氧鳥苷三磷酸（dgtp）、脫氧胞苷三磷酸（dctp）、腺苷三磷酸（atp）、鳥苷三磷酸（gtp）、胞苷三磷酸（ctp）、尿苷三磷酸（utp）中的一種或多種鈉鹽。

10、在一種具體實(shí)施方式中，所述核苷三磷酸鈉樣品的純度為hplc純度≥99%，電導(dǎo)不高于10ms/cm，進(jìn)樣量（含量）與填料的比值為1/100-1/20。

11、本發(fā)明所述陰離子交換柱以本領(lǐng)域理解的能吸附核苷三磷酸的陰離子交換柱均可。在一種具體的實(shí)施方式中，所述陰離子交換柱為含有-ch2n+?(ch3)3離子交換功能團(tuán)的強(qiáng)陰離子交換柱。

12、在一種具體實(shí)施方式中，所述洗脫條件為：

13、。

14、優(yōu)選地，所述洗脫條件為：

15、。

16、本發(fā)明中，所述核苷三磷酸四丁基銨鹽的制備方法，還包括對洗脫液進(jìn)行純化的步驟：

17、以親水色譜（hilic）層析柱為純化柱，制備步驟得到的洗脫液為樣品進(jìn)行上樣，純化水為流動(dòng)相a，乙腈為流動(dòng)相b。所述流動(dòng)相a和流動(dòng)相b混合液的配比為30-70:70-30，優(yōu)選為50：50，洗脫得到主餾分為核苷三磷酸四丁基銨鹽。

18、在一種具體實(shí)施方式中，所述純化過程中，進(jìn)行多次進(jìn)樣，比如2-8次，每次進(jìn)樣后用平衡液平衡；平衡液中所述流動(dòng)相a和流動(dòng)相b混合液的配比1-3:99-97（例如1:99、2:98、3:97）；然后用流動(dòng)相a和流動(dòng)相b的混合液洗脫得到核苷三磷酸四丁基銨鹽純品。

19、研究發(fā)現(xiàn)，以親水色譜層析柱進(jìn)行純化時(shí)，可進(jìn)行大量進(jìn)樣，以120g的填料柱為例，每次可進(jìn)樣20ml，可連續(xù)進(jìn)樣2-8次。進(jìn)樣量大，脫鹽處理能夠節(jié)省大量的時(shí)間成本和運(yùn)行成本。以進(jìn)樣3次為例，平衡加樣條件為：

20、。

21、在具體實(shí)施方式中，所述純化步驟還包括收集純品的步驟，包括用流動(dòng)相a和流動(dòng)相b的混合液進(jìn)行沖洗，接收主峰餾分，即得核苷三磷酸四丁基銨鹽純品。

22、所述核苷四丁基銨鹽也可根據(jù)需求制備成穩(wěn)定性更好的固體的形式，尤其粉末形式，具體方法包括將hilic層析柱洗脫下來的核苷三磷酸四丁基銨鹽純品快速冷凍，待產(chǎn)品分層時(shí)，棄去乙腈層，留水層繼續(xù)冷凍，待冷凍成固體時(shí)，啟動(dòng)凍干程序，得凍干粉。

23、本發(fā)明上述制備方法得到的核苷三磷酸四丁基銨鹽可在pcr、mngs測序、高度擴(kuò)增的高通量測序、lamp、多重?cái)U(kuò)增中的應(yīng)用。

24、本發(fā)明取得了如下積極效果：本發(fā)明通過簡單易得的原料制得核苷三磷酸四丁基銨鹽，制備方法采用離子交換柱層析進(jìn)行轉(zhuǎn)鹽，填料價(jià)格低，設(shè)備要求低，載樣量高，單針運(yùn)行時(shí)間短，能夠快速得到核苷的四丁基銨鹽。采用hilic層析連續(xù)進(jìn)樣法能夠大量上樣提高進(jìn)樣量，即能解決修飾核苷酸極性大不能掛c18柱，又能夠克服hilic柱不能上大體積水溶液的缺點(diǎn)。通過hilic柱連續(xù)進(jìn)樣，可以脫去游離性四丁基銨鹽，得到核苷三磷酸四丁基銨鹽。該方法能夠有效進(jìn)行小量修飾核苷酸稀有鹽型的處理，成本低，時(shí)間快，并且能處理毫克級量的產(chǎn)品，且有較高的收率；本發(fā)明的方法根據(jù)需求可制備1mg到100g的核苷三磷酸四丁基銨鹽。

技術(shù)特征：

1.核苷三磷酸四丁基銨鹽，其特征在于，以核苷三磷酸鹽和四丁基氫氧化銨為原料反應(yīng)制得，所述核苷三磷酸鹽包括核糖核苷三磷酸鹽、脫氧核糖核苷三磷酸鹽、修飾性核糖核苷三磷酸鹽、修飾性脫氧核糖核苷三磷酸鹽。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核苷三磷酸四丁基銨鹽，其特征在于，所述原料核苷三磷酸鹽為核苷三磷酸鈉，和或；

3.一種權(quán)利要求1所述核苷三磷酸四丁基銨鹽的制備方法，其特征在于，陰離子交換柱為制備柱，以核苷三磷酸鹽為樣品上樣，四丁基氫氧化銨水溶液為流動(dòng)相a，四丁基氯化銨水溶液為流動(dòng)相b，洗脫得到含核苷三磷酸四丁基銨鹽的洗脫液；所述核苷三磷酸鹽包括核糖核苷三磷酸鹽、脫氧核糖核苷三磷酸鹽、修飾性核糖核苷三磷酸鹽、修飾性脫氧核糖核苷三磷酸鹽。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述流動(dòng)相a為濃度5-15mm四丁基氫氧化銨水溶液；所述流動(dòng)相b為濃度0.5-2m的四丁基氯化銨水溶液；和/或，

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，核苷三磷酸鹽包括脫氧胸苷三磷酸（dttp）、脫氧腺苷三磷酸（datp）、脫氧鳥苷三磷酸（dgtp）、脫氧胞苷三磷酸（dctp）、腺苷三磷酸（atp）、鳥苷三磷酸（gtp）、胞苷三磷酸（ctp）、尿苷三磷酸（utp）中的一種或多種鈉鹽。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，洗脫條件為：

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，還包括對洗脫液進(jìn)行純化的步驟：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述以親水色譜層析柱進(jìn)行純化時(shí)，多次進(jìn)樣；每次進(jìn)樣后用平衡液平衡；平衡液中所述流動(dòng)相a和流動(dòng)相b混合液的配比1-3:99-97。

9.根據(jù)權(quán)利要求3-8任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，還包括將核苷三磷酸四丁基銨純品制備成固體的形式，將親水色譜層析柱洗得到的核苷三磷酸四丁基銨鹽純品快速冷凍，待產(chǎn)品分層時(shí)，棄去乙腈層，留水層繼續(xù)冷凍，待冷凍成固體時(shí)，啟動(dòng)凍干程序，得凍干粉。

10.權(quán)利要求3-9任一項(xiàng)所述的制備方法得到的核苷三磷酸四丁基銨鹽在pcr、mngs測序、高度擴(kuò)增的高通量測序、lamp、多重?cái)U(kuò)增中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及核苷三磷酸四丁基銨鹽及其制備方法，以核苷三磷酸鹽和四丁基氫氧化銨為原料反應(yīng)制得，本發(fā)明通過簡單易得的原料制得核苷三磷酸四丁基銨鹽，工藝設(shè)備要求低，可制得毫克量級產(chǎn)品。

技術(shù)研發(fā)人員：朱福各,馬龍,栗傳領(lǐng),李穆桐,白云濤
受保護(hù)的技術(shù)使用者：天津奧利芙生物技術(shù)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9