本發(fā)明涉及基因工程，特別涉及一種糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、萊鮑迪苷d和萊鮑迪苷e是從天然甜味劑甜葉菊中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)化合物，二者的甜度約為蔗糖的200-300倍，均具有較好的甜味特性，被廣泛用于低熱量飲料、糖果、糕點(diǎn)、乳制品等食品中，作為天然甜味劑替代蔗糖。

2、隨著對(duì)甜味劑口感要求的提高，對(duì)萊鮑迪苷d、萊鮑迪苷e等產(chǎn)品的需求越來(lái)越大。然而，在甜葉菊植物中萊鮑迪苷d、萊鮑迪苷e含量極低，分離提取成本較高，無(wú)法滿足市場(chǎng)需求。糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1在尿苷二磷酸葡萄糖（udpg）存在的條件下能夠分別催化萊鮑迪苷a、甜菊苷stv生成萊鮑迪苷d和萊鮑迪苷e，但野生型糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1的酶活較低，限制了萊鮑迪苷d、萊鮑迪苷e的工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體及其應(yīng)用，用于克服現(xiàn)有技術(shù)中野生型糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1的酶活較低的問(wèn)題。

2、第一方面，本發(fā)明提供一種糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體，由如seq?id?no.1所示氨基酸序列的第380位氨基酸、第204位氨基酸、第208位氨基酸進(jìn)行單點(diǎn)突變或多點(diǎn)組合突變獲得：

3、第380位氨基酸由g突變?yōu)閐；第204位氨基酸由l突變?yōu)閍；第208位氨基酸由f突變?yōu)閍。

4、與現(xiàn)有技術(shù)的野生型糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1相比，本發(fā)明提供的糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體提高了酶的催化活性，是野生型糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1的1.1~2倍。

5、進(jìn)一步地，糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體的氨基酸序列如seq?id?no.2、seq?idno.3、seq?id?no.4或seq?id?no.5所示。

6、第二方面，本發(fā)明提供一種編碼基因，具有編碼上述糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體的核苷酸序列。

7、編碼上述糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體的核苷酸序列如seq?id?no.7、seq?id?no.8、seq?id?no.9或seq?id?no.10所示。

8、第三方面，本發(fā)明提供一種生物材料，生物材料包含上述編碼基因，生物材料為表達(dá)單元、表達(dá)載體或基因工程菌。

9、第四方面，本發(fā)明提供一種糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體的制備方法，包括以下步驟：

10、以含有野生型糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1編碼基因的質(zhì)粒為模板，使用定點(diǎn)突變引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到含有糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體編碼基因的重組質(zhì)粒。

11、將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，得到重組菌株。

12、誘導(dǎo)重組菌株發(fā)酵產(chǎn)酶，得到糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體酶液。

13、第五方面，本發(fā)明提供上述突變體、編碼基因或生物材料在制備萊鮑迪苷d或萊鮑迪苷e中的應(yīng)用。

14、發(fā)明人試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體能夠催化甜菊苷stv生成萊鮑迪苷e、催化萊鮑迪苷a生成萊鮑迪苷d，說(shuō)明糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體具有c19位β-（1?,2）-o-葡萄糖糖基化活性。

15、進(jìn)一步地，將糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體與蔗糖合酶聯(lián)用，以萊鮑迪苷a、udpg、蔗糖為底物制備萊鮑迪苷d。

16、上述技術(shù)方案將糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體與蔗糖合酶聯(lián)用，轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體以萊鮑迪苷a和udpg為底物催化生成萊鮑迪苷d和副產(chǎn)物udp，蔗糖合酶能夠以副產(chǎn)物udp和蔗糖為底物重新合成udpg，從而建立了udpg循環(huán)再生體系，避免了udpg的額外添加，節(jié)約了生產(chǎn)成本。

17、進(jìn)一步地，將糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體與蔗糖合酶聯(lián)用，以萊鮑迪苷a、udpg、蔗糖為底物制備萊鮑迪苷d的反應(yīng)體系中各物料的終濃度如下：

18、磷酸鈉緩沖液50~100mm，糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體酶液30~50od，蔗糖合酶酶液15~20od，蔗糖600~700mm，udpg?1.5~2mm，萊鮑迪苷a?40~60mm；所述反應(yīng)體系的ph值為7~7.5，反應(yīng)溫度為35~40℃。

19、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件和反應(yīng)體系中物料濃度的優(yōu)化，進(jìn)一步提高了萊鮑迪苷a的轉(zhuǎn)化率和萊鮑迪苷d的產(chǎn)量。

20、進(jìn)一步地，將糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體與蔗糖合酶聯(lián)用，以甜菊苷stv、udpg、蔗糖為底物制備萊鮑迪苷e。

21、上述技術(shù)方案將糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體與蔗糖合酶聯(lián)用，轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體以甜菊苷stv和udpg為底物催化生成萊鮑迪苷e和副產(chǎn)物udp，蔗糖合酶能夠以副產(chǎn)物udp和蔗糖為底物重新合成udpg，從而建立了udpg循環(huán)再生體系，避免了udpg的額外添加，節(jié)約了生產(chǎn)成本。

22、進(jìn)一步地，將糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體與蔗糖合酶聯(lián)用，以甜菊苷stv、udpg、蔗糖為底物制備萊鮑迪苷e的反應(yīng)體系中各物料的終濃度如下：

23、磷酸鈉緩沖液50~100mm，糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體酶液20~50od，蔗糖合酶酶液15~20od，蔗糖400~700mm，udpg?1~2mm，甜菊苷stv?30~40mm；所述反應(yīng)體系的ph值為7~7.5，反應(yīng)溫度為35~40℃。

24、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件和反應(yīng)體系中物料濃度的優(yōu)化，進(jìn)一步提高了甜菊苷stv的轉(zhuǎn)化率和萊鮑迪苷e的產(chǎn)量。

技術(shù)特征：

1.一種糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體，其特征在于，由如seq?id?no.1所示氨基酸序列的第380位氨基酸、第204位氨基酸、第208位氨基酸進(jìn)行單點(diǎn)突變或多點(diǎn)組合突變獲得：

2.一種編碼基因，其特征在于，具有編碼權(quán)利要求1所述的糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體的核苷酸序列。

3.一種生物材料，其特征在于，所述生物材料包含權(quán)利要求2所述的編碼基因，所述生物材料為表達(dá)單元、表達(dá)載體或基因工程菌。

4.一種糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

5.權(quán)利要求1所述的突變體、權(quán)利要求2所述的編碼基因或權(quán)利要求3所述的生物材料在制備萊鮑迪苷d或萊鮑迪苷e中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，將糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體與蔗糖合酶聯(lián)用，以萊鮑迪苷a、udpg、蔗糖為底物制備萊鮑迪苷d。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，將糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體與蔗糖合酶聯(lián)用，以萊鮑迪苷a、udpg、蔗糖為底物制備萊鮑迪苷d的反應(yīng)體系中各物料的終濃度如下：

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，將糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體與蔗糖合酶聯(lián)用，以甜菊苷stv、udpg、蔗糖為底物制備萊鮑迪苷e。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，將糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體與蔗糖合酶聯(lián)用，以甜菊苷stv、udpg、蔗糖為底物制備萊鮑迪苷e的反應(yīng)體系中各物料的終濃度如下：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)一種糖基轉(zhuǎn)移酶UGT91C1突變體及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。該糖基轉(zhuǎn)移酶UGT91C1突變體由如SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列的第380位氨基酸、第204位氨基酸、第208位氨基酸進(jìn)行單點(diǎn)突變或多點(diǎn)組合突變獲得：第380位氨基酸由G突變?yōu)镕；第204位氨基酸由L突變?yōu)锳；第208位氨基酸由F突變?yōu)锳。本發(fā)明提供的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT91C1突變體提高了酶的催化活性，是野生型糖基轉(zhuǎn)移酶UGT91C1的1.1~2倍。

技術(shù)研發(fā)人員：朱理平,徐良平,宋維才,杜萌萌,王魯明,王慧,王濱
受保護(hù)的技術(shù)使用者：諸城市浩天藥業(yè)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9