本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物，具體涉及混合糖利用能力提高的嗜熱毀絲霉基因工程菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)是豐富的可再生資源，以其為原料利用微生物細(xì)胞工廠合成高附加值產(chǎn)品，不僅能夠減少對化石資源的依賴，還有助于實(shí)現(xiàn)碳達(dá)峰目標(biāo)，具有重要的環(huán)境和經(jīng)濟(jì)意義。其中，實(shí)現(xiàn)微生物對水解產(chǎn)物混合糖的高效利用被認(rèn)為是降低產(chǎn)品成本的關(guān)鍵。但是大多數(shù)微生物在混合糖發(fā)酵時，由于碳源阻遏效應(yīng)會優(yōu)先利用混合糖中葡萄糖，延滯木糖利用，從而嚴(yán)重制約了木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化效率。因此，開發(fā)混合糖高效利用的微生物細(xì)胞工廠對于木質(zhì)纖維素高值化利用具有重要意義。

2、為實(shí)現(xiàn)微生物高效利用混合糖，當(dāng)前需要解決如下兩方面的問題：一方面是木糖轉(zhuǎn)運(yùn)的問題，具體涉及葡萄糖與木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合導(dǎo)致木糖轉(zhuǎn)運(yùn)受抑制；另一方面是木糖代謝的問題，具體涉及與木糖代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)被抑制。針對這兩方面的問題，近年來研究者開展了大量的研究工作，但是木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)研究進(jìn)展緩慢，迄今為止僅確認(rèn)了來自9種不同微生物的約30個糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有木糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力，但是部分糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對葡萄糖的親和力是木糖的10-100倍，葡萄糖的存在會強(qiáng)烈抑制木糖轉(zhuǎn)運(yùn)。因而，尋找和引入高親和力的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對于提升微生物對混合糖的利用效率至關(guān)重要。

3、嗜熱毀絲霉是一種具有生物質(zhì)高效降解能力、蛋白高效分泌能力的高溫絲狀真菌底盤菌株，在木質(zhì)纖維素降解和利用過程中具有較高的開發(fā)應(yīng)用價值。但其在混合糖利用過程中，同樣存在碳源阻遏效應(yīng)，木糖被延滯利用的問題。目前亟需挖掘引入高親和力的木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，消除葡萄糖對木糖代謝的阻遏抑制效應(yīng)，提升嗜熱毀絲霉對混合糖的利用效率，實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)低成本生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)品。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中微生物利用混合糖效率低的缺陷，本發(fā)明的目的是提供混合糖利用能力提高的嗜熱毀絲霉基因工程菌株。

2、本發(fā)明的再一目的是提供混合糖利用能力提高的嗜熱毀絲霉基因工程菌株在混合糖發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸中的應(yīng)用。

3、根據(jù)本發(fā)明的混合糖利用能力提高的嗜熱毀絲霉基因工程菌株，其中，所述嗜熱毀絲霉基因工程菌株組成型表達(dá)編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mtstp的基因，其中，所述糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mtstp的氨基酸序列如seq?id?no：3所示。

4、根據(jù)本發(fā)明的混合糖利用能力提高的嗜熱毀絲霉基因工程菌株，其中，所述嗜熱毀絲霉基因工程菌株為堿性蛋白酶基因缺陷型菌株。

5、根據(jù)本發(fā)明的混合糖利用能力提高的嗜熱毀絲霉基因工程菌株，其中，所述編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mtstp的基因的dna序列?如seq?id?no：1，糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mtstp的編碼序列如seqid?no：2所示。

6、mtstp基因組dna序列?seq?id?no：1

7、atgggcgctggcggaggcggcgacgccggcgcgttctacgatgccgcgctcaagaagcggcaggccatgatgggcaagagcggaccctcggcgctgctcaagaacttccgggtcttccgtatcgcagcctttgcctgcatcggcggtgtgctgtacggctacaaccagggcatgttctctggcgtcttggccatgccgtcgttcaacagccgtgagtgcccaacccgacccgtcctcgatagcccacatctctctctctctctctgtgtgtgtgtgttggtgtcgggagcggagcgactgagacggaaaggaacacacagacatgggcgagtatacgacgaaccagaccaagaagggatggctcactgccattctcgagctgggcgcctggctggggacgttgctctcgagtttcctcgccgaggtcctgtcgcgcaagtacggagtcctggtggcctgcgccgtcttcatgctcggcgttgtcatccagacgaccgcggtgtctgccgggcacaactccatcctggccggacggttcatcacgtgcgtatatctctccttgactcatgggccgggggaaaagggcggaagaagaagaagaagaaagtaaaaagattgctcaggaggattgctgaccgtgtgattggttgattgcagtggtatgggcgttggaagtctggccatgatcatccccatctacaactccgaggttgctccccctgaggtccgcggcgctctggtggcgacccaacagctggccatctgctttggtatcatgatcagcttctggatcgactagtgagtcttttggggttcctgggtctctccccccccccctttttccaccccactaccaccaccaccaccacccgtatcgaagcccaagctctaacccggaggcagcggcaccaactacatcggcggaacaggcgaaggacagagcgacgcggcatggctgctccccgtctgcctgcagctcgcgccggccgtcatcctgtttgtcggcatgatcttcatgcccttctccccgcgttggctgatcaaccacggccgggaggaggaggcgcgcaaggtgttgtccgagcttcgcggcatgccccccgaccacgagctcgtcgagatcgagttcctcgagatcaaggcccaatccctgttcgagaagcgctccattgccgagatgttccccgaactgagcgagcggacggcctggaacatcttcaagctccagtttgtcgccatcaagaagctcttccagaccaaggccatgtttaagcgcgtcatcgttgccaccgtgaccatgttcttccagcaggtccgtcatgtttctctcgccaatccccccccccttctttccaccttccattccccgcgatatcatttgcgctgacatgagattctcacccccccttttttggatttttttagtggacgggcatcaacgccgttctgtactatgccccctttatctttcagcagctcggcctcgacctcaacacgacctcgctcctggccacgggcgtggtcggcatcgtcatgttcatcgcgaccatcccgtccgtcctgtgggtcgaccgggccgggcgcaagcccgtgttgaccatcggcgccatcggcatggctacctgccacatcatcatcgcggtgctcgtggccaagaacatcaaccagtgggccgagcagcgggcggccggctgggcggccgtgtgcatggtctggctcttcgtcatccactttggctactcgtggggtccctgcgcctggatcatcgtcgccgagatctggccgctcagcacgcgcccctacggcgtcgccctcggcgcttccagcaactggatgaacaacttcatcgtcggccaggtcacccccgacatgctcgagggcatcccctacggcacctacatcctcttcggcctgttgacctacctgggcgcggctttcatatggttcctggttcccgagacaaagcggctgacactcgaggagatggtatacccccccccccccaaaattgcccgccgttgatcaatcgaaacacttgctaatcacggacaaaataccacgcataacaggacgtcctcttcggttccgagggtaccgctgcggccgactacgagcgcatggaagagatcaacaacgagattggcctcaaccagatcctgcgcggcgagggccgtgtcactgctccctctacgtcggatgccgagaagcccaagggtgcggaacagatggagactgtctaa。

8、mtstp編碼序列?seq?id?no：2

9、atgggcgctggcggaggcggcgacgccggcgcgttctacgatgccgcgctcaagaagcggcaggccatgatgggcaagagcggaccctcggcgctgctcaagaacttccgggtcttccgtatcgcagcctttgcctgcatcggcggtgtgctgtacggctacaaccagggcatgttctctggcgtcttggccatgccgtcgttcaacagccacatgggcgagtatacgacgaaccagaccaagaagggatggctcactgccattctcgagctgggcgcctggctggggacgttgctctcgagtttcctcgccgaggtcctgtcgcgcaagtacggagtcctggtggcctgcgccgtcttcatgctcggcgttgtcatccagacgaccgcggtgtctgccgggcacaactccatcctggccggacggttcatcactggtatgggcgttggaagtctggccatgatcatccccatctacaactccgaggttgctccccctgaggtccgcggcgctctggtggcgacccaacagctggccatctgctttggtatcatgatcagcttctggatcgactacggcaccaactacatcggcggaacaggcgaaggacagagcgacgcggcatggctgctccccgtctgcctgcagctcgcgccggccgtcatcctgtttgtcggcatgatcttcatgcccttctccccgcgttggctgatcaaccacggccgggaggaggaggcgcgcaaggtgttgtccgagcttcgcggcatgccccccgaccacgagctcgtcgagatcgagttcctcgagatcaaggcccaatccctgttcgagaagcgctccattgccgagatgttccccgaactgagcgagcggacggcctggaacatcttcaagctccagtttgtcgccatcaagaagctcttccagaccaaggccatgtttaagcgcgtcatcgttgccaccgtgaccatgttcttccagcagtggacgggcatcaacgccgttctgtactatgccccctttatctttcagcagctcggcctcgacctcaacacgacctcgctcctggccacgggcgtggtcggcatcgtcatgttcatcgcgaccatcccgtccgtcctgtgggtcgaccgggccgggcgcaagcccgtgttgaccatcggcgccatcggcatggctacctgccacatcatcatcgcggtgctcgtggccaagaacatcaaccagtgggccgagcagcgggcggccggctgggcggccgtgtgcatggtctggctcttcgtcatccactttggctactcgtggggtccctgcgcctggatcatcgtcgccgagatctggccgctcagcacgcgcccctacggcgtcgccctcggcgcttccagcaactggatgaacaacttcatcgtcggccaggtcacccccgacatgctcgagggcatcccctacggcacctacatcctcttcggcctgttgacctacctgggcgcggctttcatatggttcctggttcccgagacaaagcggctgacactcgaggagatggacgtcctcttcggttccgagggtaccgctgcggccgactacgagcgcatggaagagatcaacaacgagattggcctcaaccagatcctgcgcggcgagggccgtgtcactgctccctctacgtcggatgccgagaagcccaagggtgcggaacagatggagactgtctaa。

10、mtstp的氨基酸序列如seq?id?no：3

11、mgaggggdagafydaalkkrqammgksgpsallknfrvfriaafaciggvlygynqgmfsgvlampsfnshmgeyttnqtkkgwltailelgawlgtllssflaevlsrkygvlvacavfmlgvviqttavsaghnsilagrfitgmgvgslamiipiynsevappevrgalvatqqlaicfgimisfwidygtnyiggtgegqsdaawllpvclqlapavilfvgmifmpfsprwlinhgreeearkvlselrgmppdhelveiefleikaqslfekrsiaemfpelsertawnifklqfvaikklfqtkamfkrvivatvtmffqqwtginavlyyapfifqqlgldlnttsllatgvvgivmfiatipsvlwvdragrkpvltigaigmatchiiiavlvakninqwaeqraagwaavcmvwlfvihfgyswgpcawiivaeiwplstrpygvalgassnwmnnfivgqvtpdmlegipygtyilfglltylgaafiwflvpetkrltleemdvlfgsegtaaadyermeeinneiglnqilrgegrvtapstsdaekpkgaeqmetv。

12、根據(jù)本發(fā)明的利用混合糖生產(chǎn)蘋果酸能力提高的毀絲霉基因工程菌株，其中，所述嗜熱毀絲霉基因工程菌株組成型表達(dá)編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mtstp的基因，并且表達(dá)編碼異源的蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白trmae的基因，其中，所述糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mtstp的氨基酸序列如seq?id?no：3所示，所述異源的蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白trmae的氨基酸序列如seq?id?no：5所示。

13、trmae的編碼基因的核苷酸序列，seq?id?no：4：

14、atgaaagcggcattccctcatgccgtcgacataaacgacccgaaccgaccaaagcttcctatccgacagaggcttcagcacttcacatgggcgtggtacactctgcccatgagcacggggggtctctccctgctcatctacgcacagccataccagttcgcgggcgaaagggtgattggcttagtcgtatacattatcaacctcatcatcttttccttggtgacaatggccatgatggctcgcttcttcctacacgccggagagtttgtccggtccatcactcatccccgtgaaggcttcttcgtccccacattcttcctgtctctggccaccatcatcacgagcacgcagcgttatgccataccggacgaccatccgatactggaacctgccgtcaagattgcattctgggtgtacgtcgccctgacggcggttctagccctgggccagtacagctacgtctttgcggcccataacctcagcctcaagaccttcatgccaaccttgattctgcccatcttccccatcatgctttcaggaaccattgcatccgtcatcgcgggcacgcagcccgagttcgatgcgatgcccatcctagtcgccggcctcacctgccagggcctcggcatgtctgtggccatcctcatgtacgcccacatgattgggcgcctgctccagttcggcctgcccaaccgggagcatcgacccggtctcttcatgtgcgtcggtccgccggcatttaccgccttggccctggtcggcatggccaacggcgtgcctgagggcatcagcgagctgggcatcgacaagagcgtcatccaggtcgtggctatcctcgtcgccgtgttcctgtgggcgctgagcttctggtggtttggcattgccgtcattgctgttgtctcgtcgccgccaaagtatttccatctgggctggtgggccatggtgtttcccaacacgggctttacgctggcgacgatttccattgccaaggagttgcttagtcctagtctgcagtgggttactattggtatgagctgctgcatctttaccatcttcatctttgtctttgtgaaccatgttcgtgctgtgatcatccaggacatcatgtatccgggacgagatgagaatgtggaggatcactga。

15、trmae的氨基酸序列，seq?id?no：5：

16、mkaafphavdindpnrpklpirqrlqhftwawytlpmstgglslliyaqpyqfagerviglvvyiinliifslvtmammarfflhagefvrsithpregffvptfflslatiitstqryaipddhpilepavkiafwvyvaltavlalgqysyvfaahnlslktfmptlilpifpimlsgtiasviagtqpefdampilvagltcqglgmsvailmyahmigrllqfglpnrehrpglfmcvgppaftalalvgmangvpegiselgidksviqvvailvavflwalsfwwfgiaviavvssppkyfhlgwwamvfpntgftlatisiakellspslqwvtigmscciftififvfvnhvraviiqdimypgrdenvedh。

17、根據(jù)本發(fā)明的提高嗜熱毀絲霉利用混合糖生產(chǎn)蘋果酸的能力的方法，包括以下步驟：

18、構(gòu)建包含編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mtstp的基因的重組表達(dá)載體，其中，在所述重組表達(dá)載體中以組成型啟動子調(diào)控所述編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mtstp的基因，所述糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mtstp的氨基酸序列如seq?id?no：3所示；

19、構(gòu)建包含編碼異源的蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白trmae的基因的重組表達(dá)載體；

20、將所述包含編碼異源的蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白trmae的基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述嗜熱毀絲霉中；

21、將構(gòu)建的所述包含編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mtstp的基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到嗜熱毀絲霉中；

22、篩選得到轉(zhuǎn)化成功的嗜熱毀絲霉基因工程菌株。

23、根據(jù)本發(fā)明的提高嗜熱毀絲霉利用混合糖生產(chǎn)蘋果酸的能力的方法，其中，所述異源的蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白trmae的氨基酸序列如seq?id?no：5所示。

24、本發(fā)明提供了上述混合糖利用能力提高的嗜熱毀絲霉基因工程菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的應(yīng)用。

25、根據(jù)本發(fā)明的利用混合糖生產(chǎn)蘋果酸能力提高的毀絲霉基因工程菌株，其中，所述嗜熱毀絲霉基因工程菌株為堿性蛋白酶基因缺陷型菌株。

26、根據(jù)本發(fā)明的利用混合糖生產(chǎn)蘋果酸能力提高的毀絲霉基因工程菌株，其中，所述編碼異源的蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白trmae的基因的核苷酸序列如seq?id?no：4所示。

27、本發(fā)明的有益效果在于：

28、使用本發(fā)明所述混合糖利用能力提高的嗜熱毀絲霉工程菌株，在混合糖體系下其木糖利用率較出發(fā)菌株提高了3.97倍；使用該混合糖利用能力提高的菌株在利用混合糖發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸中，其蘋果酸產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了0.63倍。本發(fā)明對混合糖高效利用底盤細(xì)胞的構(gòu)建具有重要的借鑒指導(dǎo)意義，對降低木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成本具有重要價值。