本發(fā)明涉及高分子材料領(lǐng)域，具體涉及一種兩親性三嵌段共聚物及其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、現(xiàn)有的成膜技術(shù)主要利用磷脂分子或兩親性嵌段共聚物在水油界面上的自組裝性質(zhì)來形成兩親性分子膜。磷脂分子為天然兩性分子，一端為親水的含氮或磷的頭，另一端為疏水(親油)的長烴基鏈。在排布時(shí)親水端相互靠近，疏水端相互靠近，形成磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)。由于磷脂形成的磷脂雙分子層（簡稱為磷脂膜）具有與生物分子的天然親和性，與多種通道蛋白（簡稱為納米孔蛋白）的親和性均較佳且納米孔蛋白嵌入效率高，因此在納米孔測序領(lǐng)域，常使用磷脂膜模擬細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)承載納米孔蛋白進(jìn)行測序。然而由于磷脂分子的機(jī)械強(qiáng)度弱，磷脂膜存在穩(wěn)定性差等缺陷。這雖然可以滿足大多數(shù)生物、物理和生理實(shí)驗(yàn)的需要，但對于通道蛋白的技術(shù)應(yīng)用來說遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。

2、現(xiàn)有的用于成仿生膜的聚合物為兩親性嵌段共聚物（例如聚硅氧烷共聚物pmoxa-pdms-pmoxa），其分子間作用力強(qiáng)于磷脂分子，分子堆砌密度大，因此形成的聚合物膜機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性高。然而，現(xiàn)有的兩親性嵌段共聚物存在生物親和性和成膜性能低等缺點(diǎn)，具體體現(xiàn)在嵌孔時(shí)必須配合較高強(qiáng)度的外界刺激（例如較高強(qiáng)度的電壓刺激）、需要使用較多量的納米孔蛋白等方面。為提高聚合物膜的生物親和性，wo2023123434a1公開了一種磷脂/聚合物仿生復(fù)合配方膜及其制備方法和應(yīng)用，其通過采用包含聚合物分子和磷脂分子的仿生復(fù)合配方膜，以增強(qiáng)聚硅氧烷共聚物仿生膜的生物親和性，然而其操作復(fù)雜，仍需要使用較多量的納米孔蛋白，因此應(yīng)用場景較為受限。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、第一方面，本發(fā)明提供了一種兩親性三嵌段共聚物，其特征在于，所述兩親性三嵌段共聚物具有親水嵌段a-疏水嵌段b-親水嵌段a結(jié)構(gòu)，其中所述親水嵌段a的結(jié)構(gòu)單元包括聚(2-甲基惡唑啉)，所述疏水嵌段b的結(jié)構(gòu)單元包括聚(乳酸)，所述親水嵌段a的聚合度為n，所述疏水嵌段b的聚合度為m，m+n≤25；所述親水嵌段a的總聚合度與所述兩親性三嵌段共聚物的總聚合度的比例包括20%-40%，所述兩親性三嵌段共聚物的數(shù)均分子量包括2000-6000?g/mol。

2、如本文所使用，“聚合度”是指兩親性三嵌段共聚物的聚合物嵌段（例如親水嵌段、疏水嵌段）的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元的數(shù)量。在一些實(shí)施例中，所述兩親性三嵌段共聚物具有親水嵌段a-疏水嵌段b-親水嵌段a結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施例中，所述兩親性三嵌段共聚物具有pmoxan-plam-pmoxan結(jié)構(gòu)，其中m代表疏水嵌段b的聚合度，n代表親水嵌段a的聚合度，所述親水嵌段a的總聚合度為2n，所述兩親性三嵌段共聚物的總聚合度為2n+m。在一些實(shí)施例中，m和n均為整數(shù)。在一些實(shí)施例中，m為≥1的整數(shù)，n為≥1的整數(shù)。在一些實(shí)施例中，所述親水嵌段a的聚合度范圍為大約1至大約5。在一些實(shí)施例中，所述疏水嵌段b的聚合度范圍為大約1至大約20。

3、在一些實(shí)施例中，m+n≤20。

4、在一些實(shí)施例中，n/m包括1:3-8。

5、在一些實(shí)施例中，n/m包括（1-2）:（6-7）。

6、在一些實(shí)施例中，所述兩親性三嵌段共聚物為ho-pmoxan-plam-pmoxan-oh，其中m、n表示聚合度。

7、在一些實(shí)施例中，n為2或3或4。

8、在一些實(shí)施例中，m為12或13或14。

9、在一些實(shí)施例中，所述兩親性三嵌段共聚物為ho-pmoxa4-pla13-pmoxa4-oh。

10、在一些實(shí)施例中，所述兩親性三嵌段共聚物為ho-pmoxa2-pla13-pmoxa2-oh。

11、在一些實(shí)施例中，所述兩親性三嵌段共聚物為ma-pmoxan-plam-pmoxan-ma，其中m、n表示聚合度。

12、在一些實(shí)施例中，n為2或3或4。

13、在一些實(shí)施例中，m為12或13或14。

14、在一些實(shí)施例中，所述兩親性三嵌段共聚物為ma-pmoxa4-pla13-pmoxa4-ma。

15、在一些實(shí)施例中，所述兩親性三嵌段共聚物為ma-pmoxa2-pla13-pmoxa2-ma。

16、第二方面，本發(fā)明還提供了上述兩親性三嵌段共聚物在制備仿生膜中的應(yīng)用。

17、在一些實(shí)施例中，所述仿生膜用于嵌入納米孔蛋白。

18、在一些實(shí)施例中，所述應(yīng)用包括納米孔測序。

19、在一些實(shí)施例中，所述嵌入的方法包括向仿生膜處加入納米孔蛋白溶液后，施加嵌孔電壓，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)所述納米孔蛋白的嵌入。

20、在一些實(shí)施例中，單個(gè)微孔結(jié)構(gòu)的所述仿生膜處的納米孔蛋白溶液的終濃度包括1-2×10-6mg/ml。

21、在一些實(shí)施例中，單個(gè)微孔結(jié)構(gòu)的所述仿生膜處的納米孔蛋白溶液的加入體積包括1-5×10-3μl。

22、在一些實(shí)施例中，所述嵌孔電壓包括300-400?mv。

23、在一些實(shí)施例中，所述仿生膜的膜電容值為15-40?pf。

24、在一些實(shí)施例中，所述仿生膜通過以下方法制備得到：

25、s301?制備兩親性三嵌段共聚物溶液；

26、在一些實(shí)施例中，所述兩親性三嵌段共聚物溶液的溶劑包括硅油、甲基苯基硅油、正己烷、pdms、癸烷和十六烷中的一種或多種。

27、在一些實(shí)施例中，所述兩親性三嵌段共聚物溶液中所述兩親性三嵌段共聚物的質(zhì)量濃度為10-20?mg/ml。

28、s302?制備極性溶液；

29、在一些實(shí)施例中，所述極性溶液包括磷酸鹽緩沖溶液、含有kcl或nacl的hepes緩沖溶液、含有kcl或nacl的caps緩沖溶液、或含有h3po4、k2[fe(cn)6]、k3[fe(cn)6]的caps緩沖溶液。

30、s303?將所述極性溶液加入到經(jīng)預(yù)處理的納米孔測序芯片中；

31、s304?將所述兩親性三嵌段共聚物溶液加入到所述納米孔測序芯片的微孔結(jié)構(gòu)后，加入所述極性溶液，所述兩親性三嵌段共聚物在所述微孔結(jié)構(gòu)處自組裝成所述仿生膜。

32、在一些實(shí)施例中，所述納米孔測序芯片通常具有≥2個(gè)微孔結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施例中，所述納米孔測序芯片具有256個(gè)微孔結(jié)構(gòu)。

33、在一些實(shí)施例中，單個(gè)微孔結(jié)構(gòu)的所述仿生膜處的納米孔蛋白溶液的終濃度包括1-2×10-6mg/ml。

34、在一些實(shí)施例中，單個(gè)微孔結(jié)構(gòu)的所述仿生膜處的納米孔蛋白溶液的加入體積包括1-5×10-3μl。

35、在一些實(shí)施例中，加入的納米孔蛋白溶液的總體積包括0.6-0.8?μl。

36、在一些實(shí)施例中，所述嵌孔電壓包括300-400?mv。

37、在一些實(shí)施例中，所述仿生膜的膜電容值為15-40?pf。

38、第三方面，本發(fā)明還提供了上述兩親性三嵌段共聚物的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：

39、s101?將乙二醇、丙交酯和第一催化劑加入反應(yīng)容器中，獲得第一混合物；

40、在一些實(shí)施例中，所述反應(yīng)容器包括耐壓封管。

41、在一些實(shí)施例中，所述乙二醇和所述丙交酯的摩爾比（投料比，下同）包括1:15-40。

42、s102?將所述第一混合物在第一溫度下油浴反應(yīng)第一時(shí)間，獲得第一產(chǎn)物；

43、在一些實(shí)施例中，所述第一時(shí)間包括15-20小時(shí)。

44、在一些實(shí)施例中，所述第一溫度包括100-110℃。

45、在一些實(shí)施例中，所述第一催化劑包括辛酸亞錫。

46、s103?將所述第一產(chǎn)物、吡啶和三氟甲磺酸酐混合并反應(yīng)第二時(shí)間，獲得第二產(chǎn)物；

47、在一些實(shí)施例中，所述第一產(chǎn)物和所述三氟甲磺酸酐的摩爾比包括1:5-10。

48、在一些實(shí)施例中，所述第二時(shí)間包括0.25-1小時(shí)。

49、s104?將所述第二產(chǎn)物和2-甲基-2-惡唑啉混合并反應(yīng)第三時(shí)間，獲得第三產(chǎn)物；

50、在一些實(shí)施例中，所述第三時(shí)間包括0.25-1小時(shí)。

51、s105?向所述第三產(chǎn)物中加入三乙胺并反應(yīng)第四時(shí)間，獲得第四產(chǎn)物；

52、在一些實(shí)施例中，所述第四時(shí)間包括0.5-2小時(shí)。

53、在一些實(shí)施例中，所述第二產(chǎn)物和所述三乙胺的摩爾比包括1:2-5。

54、在一些實(shí)施例中，所述第二產(chǎn)物和所述2-甲基-2-惡唑啉的摩爾比包括1:4-15。

55、在一些實(shí)施例中，所述方法還包括s106?將所述第四產(chǎn)物和甲基丙烯酸異氰基乙酯混合并反應(yīng)，獲得第五產(chǎn)物。

56、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果至少包括以下方面：

57、由于兩親性嵌段共聚物的聚合物分子間相互作用力強(qiáng)，因此，聚合物膜在穩(wěn)定性等方面優(yōu)于磷脂膜，但是，其生物親和性較差，這不僅體現(xiàn)在成膜率低，還體現(xiàn)在嵌孔必須配合較高強(qiáng)度的外界刺激、需要使用較多量的納米孔蛋白等方面。

58、聚乳酸是一種生物可降解聚酯聚合物，即這類聚合物分子鏈上各個(gè)結(jié)構(gòu)單元通過易水解的酯鍵連接，因此現(xiàn)有技術(shù)常將聚乳酸應(yīng)用至緩釋等領(lǐng)域，利用其生物可降解性，以釋放出例如蛋白質(zhì)等分子。此外，還有報(bào)道稱，當(dāng)聚乳酸的分子量小于3000時(shí)，力學(xué)性能差，實(shí)用價(jià)值不高；只有當(dāng)聚乳酸的相對分子量大于6000，才會有較好的物理和力學(xué)性能。

59、本發(fā)明提供了一種兩親性三嵌段共聚物，即以聚(乳酸)作為中間疏水嵌段b，聚(2-甲基惡唑啉)作為兩側(cè)親水嵌段a的結(jié)構(gòu)為pmoxan-plam-pmoxan的兩親性三嵌段共聚物。本發(fā)明通過控制聚合物嵌段的聚合度及其比例，精密地調(diào)控了聚合物嵌段結(jié)構(gòu)單元間的相互作用方式并保證了兩親性三嵌段共聚物中的聚乳酸的流變學(xué)特性（例如降解速度、抗沖強(qiáng)度、親疏水性、熱穩(wěn)定性等）。結(jié)果顯示，本發(fā)明提供的兩親性三嵌段共聚物不僅成膜率高，而且掉膜率極低，第60天掉膜率可以控制在2.5%左右。換句話說，本發(fā)明提供的兩親性三嵌段共聚物不僅能夠成功地自組裝形成仿生膜，而且在長期的緩沖液以及電壓刺激的環(huán)境下，不會發(fā)生降解，更不會將納米孔蛋白釋放，穩(wěn)定性甚至高于公認(rèn)的穩(wěn)定性能較好的聚硅氧烷共聚物形成的仿生膜。

60、需要說明的是，兩親性三嵌段共聚物以及其形成的仿生膜的化學(xué)性質(zhì)都影響納米孔蛋白的嵌入，生物實(shí)體和仿生膜的結(jié)合需要更加苛刻的條件。本發(fā)明通過將聚合物嵌段的聚合度及其比例（例如親水嵌段的總聚合度占比、親水嵌段和疏水嵌段的聚合度的比值）、數(shù)均分子量控制在合適水平，不僅保證了高成膜率，而且保證了良好的膜-蛋白相互作用，即本發(fā)明提供的兩親性三嵌段共聚物能夠與不同的納米孔蛋白均適配且納米孔蛋白能夠在其形成的仿生膜上長期穩(wěn)定存在（例如60天以上），生物親和性非常接近磷脂膜，比聚硅氧烷共聚物形成仿生膜所需的生物蛋白的量更少、嵌孔電壓更低。與聚硅氧烷共聚物形成的仿生膜相比，本發(fā)明合成的兩親性三嵌段共聚物具有優(yōu)異的生物親和性、膜孔匹配度和容易實(shí)現(xiàn)的嵌孔條件，嵌孔所需電壓刺激低、蛋白量低，不僅節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本，而且一定程度上避免了較高的嵌孔電壓的刺激導(dǎo)致的納米孔蛋白的構(gòu)象不穩(wěn)定或膜破裂等問題。

61、綜上所述，本發(fā)明提供的兩親性三嵌段共聚物形成的仿生膜集合了磷脂膜和聚硅氧烷共聚物仿生膜的優(yōu)勢，即保持聚硅氧烷共聚物仿生膜所具有的穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)的情況下，成膜率、生物親和性和膜孔匹配度非常接近磷脂膜的同時(shí)，不會出現(xiàn)目前的磷脂膜穩(wěn)定性差、不易儲存等問題，適用于納米孔測序等應(yīng)用場景。