本發(fā)明屬于基因工程與酶工程，具體涉及一種酸性蛋白酶突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、蛋白酶是三大工業(yè)酶之一，約占酶制劑市場(chǎng)份額的60%左右，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、洗滌及飼料等領(lǐng)域。酸性蛋白酶是一種能在ph值為2.5-5.0環(huán)境下水解蛋白質(zhì)的酶類。酸性蛋白酶來(lái)源廣泛，可以由動(dòng)物、植物和微生物產(chǎn)生，目前商品化的酸性蛋白酶大都來(lái)源于微生物，主要是米曲霉、黑曲霉、宇佐美曲霉。霉菌酸性蛋白酶的最適ph在3.0左右，大量研究結(jié)果顯示，酸性蛋白酶的適宜溫度一般在30-50℃之間，最適作用溫度在40℃左右，在50℃以下穩(wěn)定性較好，隨酸性的降低及溫度的升高，酶活性降低，進(jìn)而影響催化效率。

2、皮革軟化是制革工業(yè)中的重要步驟，其能提高舒適度、改善手感、增強(qiáng)耐用性、增加設(shè)計(jì)靈活性等，對(duì)提高皮革的質(zhì)量和性能有著重要的意義。酸性蛋白酶通過(guò)水解生皮中的蛋白質(zhì)，特別是膠原蛋白，從而軟化皮革。在軟化過(guò)程中為了提高軟化效率通常會(huì)采用微波輻射，加快軟化過(guò)程，但微波輻照會(huì)降低酸性蛋白酶的活性，從而影響酶促反應(yīng)的最大速度。且現(xiàn)目前皮革生產(chǎn)過(guò)程中脫灰、軟化及浸酸工序通常合并處理，這需要酸性蛋白酶具有較強(qiáng)的耐酸性及酶活穩(wěn)定性，還能適應(yīng)以一體化工藝中的其他工藝條件，如高溫、高氯化鈉濃度等。因而，提高酸性蛋白酶酶活性、穩(wěn)定性及耐酸性對(duì)制革工業(yè)具有重要意義。

3、蛋白質(zhì)工程是通過(guò)基因重組技術(shù)改變或設(shè)計(jì)合成新的酶一級(jí)結(jié)構(gòu)，或改變氨基酸序列，獲得構(gòu)象穩(wěn)定的酶，蛋白質(zhì)工程是提高酶活力穩(wěn)定性最根本的方法。酶的活性、穩(wěn)定性、選擇性等特性與酶的結(jié)構(gòu)有著本質(zhì)上的聯(lián)系，結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，通過(guò)蛋白質(zhì)工程改變生產(chǎn)酶的細(xì)菌基因或氨基酸序列，獲得活性較高且穩(wěn)定的酶是提高酶活力穩(wěn)定性的根本手段。

4、基于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于以上原因，本發(fā)明的目的在于提供一種酸性蛋白酶突變體，在親本酸性蛋白酶的基礎(chǔ)上通過(guò)大量的突變篩選，最終獲得酶活性、穩(wěn)定性得到顯著提高的酸性蛋白酶突變體。

2、本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、一種酸性蛋白酶突變體，所述酸性蛋白酶突變體的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

4、本發(fā)明還提供了酸性蛋白酶突變體基因，編碼上述的酸性蛋白酶突變體。

5、本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)載體，所述的重組表達(dá)載體攜帶有上述酸性蛋白酶突變體的基因。

6、本發(fā)明還提供了一種重組宿主細(xì)胞，所述的重組宿主細(xì)胞為轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染有上述的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。

7、優(yōu)選的，所述的宿主細(xì)胞為畢赤酵母。

8、本發(fā)明還提供了所述的酸性蛋白酶突變體在蛋白質(zhì)及肽鏈降解中的應(yīng)用。

9、進(jìn)一步的，所述應(yīng)用為酶解膠原蛋白。

10、本發(fā)明還提供了所述的酸性蛋白酶突變體在紡織皮革工業(yè)、食品工業(yè)、飼料工業(yè)、酒精工業(yè)及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

11、進(jìn)一步的，所述在紡織皮革工業(yè)中應(yīng)用于軟化皮革。

12、本發(fā)明還提供了一種酶制劑，所述酶制劑包含上述的酸性蛋白酶突變體。

13、本發(fā)明具有以下有益效果：

14、本發(fā)明通過(guò)易錯(cuò)pcr技術(shù)，在體外對(duì)aspergillus?niger來(lái)源的酸性蛋白酶dhqt進(jìn)行定向進(jìn)化，篩選獲得酶活力提高的酸性蛋白酶突變體dhqtm及其重組菌株。改造后，在最適條件下，酸性蛋白酶dhqtm的酶活力為251.64u/ml，與親本酸性蛋白酶dhqt（203.64u/ml）對(duì)比酶活力提高了23.43%，同時(shí)在反應(yīng)過(guò)程中不易失活，具有更高的穩(wěn)定性，能夠耐受強(qiáng)酸和高鹽環(huán)境，且在酶解膠原蛋白中表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)化率，在皮革軟化中具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種酸性蛋白酶突變體，其特征在于，所述酸性蛋白酶突變體的氨基酸序列如seqid?no.1所示。

2.一種酸性蛋白酶突變體基因，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的酸性蛋白酶突變體。

3.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的重組表達(dá)載體攜帶有權(quán)利要求2所述的基因。

4.一種重組宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的重組宿主細(xì)胞為轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染有權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。

5.如權(quán)利要求4所述的重組宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞為畢赤酵母。

6.權(quán)利要求1所述的酸性蛋白酶突變體在蛋白質(zhì)及肽鏈降解中的應(yīng)用。

7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為酶解膠原蛋白。

8.權(quán)利要求1所述的酸性蛋白酶突變體在紡織皮革工業(yè)、食品工業(yè)、飼料工業(yè)、酒精工業(yè)及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述在紡織皮革工業(yè)中應(yīng)用于軟化皮革。

10.一種酶制劑，其特征在于，所述酶制劑包含權(quán)利要求1所述的酸性蛋白酶突變體。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于基因工程與酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種酸性蛋白酶突變體及其應(yīng)用。本發(fā)明以Aspergillus?niger來(lái)源的基因組DNA為基礎(chǔ)，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到親本酸性蛋白酶基因序列，通過(guò)易錯(cuò)PCR進(jìn)行隨機(jī)突變，篩選獲得酶活力提高的酸性蛋白酶突變體及其重組菌株。改造后，在最適條件下，酸性蛋白酶突變體的酶活力為251.64U/mL，與親本酸性蛋白酶（203.64U/mL）對(duì)比酶活力提高了23.43%，同時(shí)在反應(yīng)過(guò)程中不易失活，具有更高的穩(wěn)定性，能夠耐受強(qiáng)酸和高鹽環(huán)境，且在酶解膠原蛋白中表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)化率，在皮革軟化中具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：田永強(qiáng),蔣光陽(yáng),陳佳
受保護(hù)的技術(shù)使用者：四川大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9