本申請(qǐng)涉及生物，具體涉及用于檢測(cè)畢氏腸微孢子蟲(chóng)的核酸組合、試劑和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、畢氏腸微孢子蟲(chóng)(enterocyiozoon?bieneusi)?是一種人獸共患新發(fā)腸道原蟲(chóng)，通過(guò)受污染的水源和食物等途徑傳播，可感染人和多種動(dòng)物，以腹瀉為主要臨床表現(xiàn)。

2、在畢氏腸微孢子蟲(chóng)的核酸檢測(cè)方法中，絕大多數(shù)都是采用巢氏pcr經(jīng)過(guò)兩輪擴(kuò)增后進(jìn)行跑膠。巢氏pcr方法的靈敏度、特異性較高，但操作過(guò)程相對(duì)繁瑣，時(shí)間約需4-5小時(shí)，而且容易污染。本檢測(cè)方法時(shí)間較短，可在1小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于此，本申請(qǐng)一實(shí)施方式提供一種靈敏度高和特異性好的用于檢測(cè)畢氏腸微孢子蟲(chóng)的核酸組合、試劑及試劑盒；

2、本申請(qǐng)一實(shí)施方式還提供畢氏腸微孢子蟲(chóng)的檢測(cè)方法，該方法檢測(cè)靈敏且特異性好，操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)時(shí)間短。

3、技術(shù)方案包括如下：

4、用于檢測(cè)畢氏腸微孢子蟲(chóng)的核酸組合，所述核酸組合包括rpa引物和crrna；所述rpa引物包括序列如seq?id?no：4和?seq?id?no：5所示的引物對(duì)，所述crrna包括序列如seqid?no：7所示的crrna。

5、用于檢測(cè)畢氏腸微孢子蟲(chóng)的試劑，所述試劑包括所述的核酸組合。

6、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述試劑還包括rpa擴(kuò)增試劑，所述rpa擴(kuò)增試劑包括rpa酶、緩沖液和乙酸鎂中的一種或者多種。

7、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述試劑還包括crispr/cas12a檢測(cè)試劑；所述crispr/cas12a檢測(cè)試劑包括cas12a酶、緩沖液和ssdna熒光報(bào)告探針中的一種或者多種。

8、可選地，所述cas12a酶包括lbcas12a。

9、所述的核酸組合或所述的試劑在制備檢測(cè)畢氏腸微孢子蟲(chóng)的試劑盒中的用途。

10、用于檢測(cè)畢氏腸微孢子蟲(chóng)的試劑盒，包括所述的核酸組合或所述的試劑。

11、畢氏腸微孢子蟲(chóng)的檢測(cè)方法，包括：利用所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

12、在其中一個(gè)實(shí)施例中，包括如下步驟：

13、以待測(cè)樣本的dna為模版，利用所述rpa引物進(jìn)行rpa恒溫?cái)U(kuò)增；

14、以所得的rpa擴(kuò)增產(chǎn)物為模版，加入所述crispr/cas12a檢測(cè)試劑進(jìn)行crispr反應(yīng)，檢測(cè)熒光信號(hào)；以及

15、根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷待測(cè)樣本是否含有畢氏腸微孢子蟲(chóng)。

16、可選地，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷待測(cè)樣本是否含有畢氏腸微孢子蟲(chóng)，包括：

17、當(dāng)待測(cè)樣本的熒光信號(hào)強(qiáng)度比陰性對(duì)照高出4倍及以上，則樣本中含有畢氏腸微孢子蟲(chóng)；和/或，

18、選擇第1-5個(gè)循環(huán)中的任意一個(gè)的熒光值為起點(diǎn)熒光值，第60-64個(gè)循環(huán)中的任意一個(gè)的熒光值為終點(diǎn)熒光值，計(jì)算終點(diǎn)/起點(diǎn)的熒光值的比值，當(dāng)該比值大于4，則判定為陽(yáng)性結(jié)果。

19、在其中一個(gè)實(shí)施例中，rpa恒溫?cái)U(kuò)增滿(mǎn)足如下條件中的一個(gè)或多個(gè)：

20、（1）rpa恒溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系包括25μl~35μl反應(yīng)緩沖液、10?μm引物各1μl~3μl、rpa酶干粉、dna模板2μl~6μl以及280?μmol/l乙酸鎂2μl?~3μl；以及

21、（2）rpa恒溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)條件包括溫度為37℃~40℃，時(shí)間為15min~30min。

22、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述crispr反應(yīng)滿(mǎn)足如下條件中的一個(gè)或多個(gè)：

23、（1）crispr反應(yīng)的體系中，所述的crrna、cas12a酶和ssdna熒光報(bào)告探針的濃度分別為10nm~15nm、0.2μm?~1μm和0.2μm?~1μm；以及

24、（2）crispr反應(yīng)的條件包括溫度為36℃~38℃，時(shí)間為10min~30min。

25、相對(duì)于傳統(tǒng)技術(shù)，本申請(qǐng)具備如下有益效果：

26、利用本申請(qǐng)的核酸組合檢測(cè)畢氏腸微孢子蟲(chóng)具有靈敏度高特異性好等優(yōu)點(diǎn)；基于該核酸組合建立的畢氏腸微孢子蟲(chóng)的檢測(cè)方法同樣具有高靈敏和高特異性，且反應(yīng)時(shí)間短，在1小時(shí)內(nèi)可出檢測(cè)結(jié)果；此外，與實(shí)時(shí)熒光pcr方法比較，反應(yīng)過(guò)程在37℃~40℃的恒溫區(qū)間即可完成，對(duì)檢測(cè)設(shè)備的要求較低，能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測(cè)。

技術(shù)特征：

1.用于檢測(cè)畢氏腸微孢子蟲(chóng)的核酸組合，其特征在于，所述核酸組合包括rpa引物和crrna；

2.用于檢測(cè)畢氏腸微孢子蟲(chóng)的試劑，其特征在于，所述試劑包括權(quán)利要求1所述的核酸組合。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于，所述試劑還包括rpa擴(kuò)增試劑，所述rpa擴(kuò)增試劑包括rpa酶、緩沖液和乙酸鎂中的一種或者多種。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑，其特征在于，所述試劑還包括crispr/cas12a檢測(cè)試劑；所述crispr/cas12a檢測(cè)試劑包括cas12a酶、緩沖液和ssdna熒光報(bào)告探針中的一種或者多種；

5.權(quán)利要求1所述的核酸組合或權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的試劑在制備檢測(cè)畢氏腸微孢子蟲(chóng)的試劑盒中的用途。

6.用于檢測(cè)畢氏腸微孢子蟲(chóng)的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的核酸組合或權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的試劑。

7.畢氏腸微孢子蟲(chóng)的檢測(cè)方法，其特征在于，包括：利用權(quán)利要求6所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟：

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)方法，其特征在于，rpa恒溫?cái)U(kuò)增滿(mǎn)足如下條件中的一個(gè)或多個(gè)：

10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述crispr反應(yīng)滿(mǎn)足如下條件中的一個(gè)或多個(gè)：

技術(shù)總結(jié)
本申請(qǐng)涉及用于檢測(cè)畢氏腸微孢子蟲(chóng)的核酸組合、試劑和應(yīng)用。該核酸組合包括RPA引物和crRNA；所述RPA引物包括序列如SEQ?ID?NO：4和SEQ?ID?NO：5所示的引物對(duì)，所述crRNA包括序列如SEQ?ID?NO：7所示的crRNA。利用其檢測(cè)畢氏腸微孢子蟲(chóng)靈敏度高和特異性好。

技術(shù)研發(fā)人員：刁慕言,劉翼振,辛本強(qiáng),莊松寬,董瑞玲,黃曉君,陳琛,劉君,盧峰,李東曉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：深圳國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心（深圳海關(guān)口岸門(mén)診部）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9