本發(fā)明屬于分子生物學(xué)dna遺傳標(biāo)記及微生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種可以聯(lián)合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法。

背景技術(shù)：

1、近年來，微生物在宿主生長發(fā)育過程中的重要性逐漸凸顯，其影響宿主的核心功能，如生長、發(fā)育、免疫、營養(yǎng)和繁殖等。而微生物組成與豐度除受環(huán)境影響外，同時(shí)也受宿主遺傳背景的影響。已有研究報(bào)道微生物組成在個(gè)體之間顯示出穩(wěn)定的差異，不同性別之間的微生物群落特征也不相同，種群中不同基因型具備不同的微生物群落特征。這些結(jié)果均表明宿主遺傳對微生物組成的影響。因此全息組學(xué)分析，即宿主與微生物的共同聯(lián)合分析已成為微生物與宿主生態(tài)和進(jìn)化的研究熱點(diǎn)。

2、目前全息組學(xué)研究采用的策略主要以16s擴(kuò)增子測序技術(shù)結(jié)合基因分型技術(shù)，如全基因組重測序、簡化基因組測序（rad/2b-rad）等。16s擴(kuò)增子測序技術(shù)為目前微生物分析的主流技術(shù)之一，然而其僅能獲得細(xì)菌的遺傳信息，真菌和病毒的遺傳多樣性無法獲得。而且為了獲得宿主的遺傳信息，額外的宿主測序分庫仍需構(gòu)建。因此該策略需要分別獲取用于宿主基因分型和微生物分析的組織材料，并通過兩次提取和兩次建庫才能實(shí)現(xiàn)宿主和微生物信息的獲得，過程復(fù)雜，流程繁瑣。分別制備文庫及單獨(dú)測序所需的成本也較高。

3、除上述策略外，一種比16s擴(kuò)增子測序更全面的方法是鳥槍法測序。它可以對樣品內(nèi)所有微生物的基因組進(jìn)行測序，還可進(jìn)行功能分析和基因組組裝。現(xiàn)在通過鳥槍法測序文庫分析多種生物信息的方法已經(jīng)建立，可以從一個(gè)鳥槍法測序文庫實(shí)現(xiàn)全息組學(xué)分析。然而，鳥槍法需要對測序文庫進(jìn)行深度覆蓋，這意味著高昂的成本。而且目前尚未具備標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)分析流程，也并未開展應(yīng)用。

4、除此之外，上述兩種策略對材料量的巨大需求使得其在體型較小的生物，如某些貝類、蝦類等中動(dòng)態(tài)追蹤宿主與微生物的變化尤為困難。因此如何低成本的實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)全息組學(xué)追蹤是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種聯(lián)合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、一種聯(lián)合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，包括以下步驟：

4、（1）根據(jù)宿主基因組序列、微生物基因組序列及iib型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列，提取宿主及微生物的電子酶切標(biāo)簽，建立宿主-微生物的iib酶切標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫，并分別獲取微生物在不同分類級上特異且宿主也特異的序列，建立宿主-微生物iib酶切的全息組學(xué)數(shù)據(jù)庫；

5、（2）混合dna的提?。喝『谢旌蟙na的材料進(jìn)行混合dna的提??；

6、（3）使用16s?rdna可變區(qū)域v4-5區(qū)的引物對515f和907r對步驟（2）獲得的混合dna進(jìn)行擴(kuò)增，若在400bp和600bp處出現(xiàn)條帶則判定合格；

7、所述515f的核苷酸序列為：5'-gtgccagcagcggtaa?(seq?id?no:1)?；

8、所述907r的核苷酸序列為：5'-ccgtcaattcttgtagtttt?(seq?id?no:2)?；

9、16s其他區(qū)域的引物僅能與細(xì)菌的基因組序列結(jié)合，有效擴(kuò)增細(xì)菌條帶，無法與真核生物基因組序列結(jié)合。因此僅能鑒定微生物dna的存在，而無法鑒定真核生物dna是否存在。而本發(fā)明所用的引物不僅可擴(kuò)增細(xì)菌的v4-5區(qū)，片段長度約為400bp；與扇貝和對蝦基因組序列也有結(jié)合位點(diǎn)，可擴(kuò)增宿主的基因組片段，長度約為600bp。

10、（4）用步驟(3)判定合格的混合dna樣品構(gòu)建2brad/miso-rad測序文庫并進(jìn)行高通量測序；

11、（5）對步驟(4)獲得的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)，提取含有酶切位點(diǎn)的序列，將提取的測序數(shù)據(jù)中的酶切片段比對至步驟（1）構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫，然后分別進(jìn)行宿主與微生物分析。

12、優(yōu)選的，步驟（1）包括：

13、根據(jù)宿主基因組序列、微生物基因組序列及iib型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列，對已知所有微生物基因組及所分析的宿主基因組同時(shí)進(jìn)行電子酶切，獲得所有微生物及宿主的電子酶切標(biāo)簽，建立宿主-微生物的iib酶切標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫；對所述酶切標(biāo)簽，在微生物物種的不同分類級別進(jìn)行相互比對，并同時(shí)與宿主的酶切標(biāo)簽進(jìn)行相互比對，篩選出只屬于某一物種而與其他物種無重復(fù)的酶切片段，以此建立宿主-微生物iib酶切的全息組學(xué)數(shù)據(jù)庫。

14、優(yōu)選的，步驟（2）中，所述含有混合dna的材料包括擦拭組織后的棉簽、糞便、腸道或幼蟲材料；所述組織包括鰓絲、外套膜、皮膚、口腔。

15、優(yōu)選的，所述組織為鰓絲或口腔。

16、優(yōu)選的，步驟（4）中，所述構(gòu)建2brad/miso-rad?測序文庫包括構(gòu)建單標(biāo)簽文庫或構(gòu)建多個(gè)標(biāo)簽串聯(lián)文庫。

17、優(yōu)選的，步驟（4）包括：

18、用iib型限制性內(nèi)切酶酶切步驟（2）中的混合dna，根據(jù)使用的iib酶選擇相應(yīng)的接頭進(jìn)行連接，通過pcr富集連接片段，pcr產(chǎn)物回收純化，加條形碼序列標(biāo)記進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

19、優(yōu)選的，所述iib型限制性內(nèi)切酶包括alfi、aloi、baei、bcgi、bpli、bsaxi、bslfi、cspci、fali、hin4i或ppii。

20、優(yōu)選的，步驟(5）包括：

21、對步驟(4)獲得的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，按照序列不含n、序列80％以上堿基的質(zhì)量值>20原則去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)，提取含有酶切位點(diǎn)的序列，將提取的測序數(shù)據(jù)中的酶切片段比對至步驟（1）構(gòu)建的宿主-微生物iib酶切的全息組學(xué)數(shù)據(jù)庫；比對至數(shù)據(jù)庫中的宿主序列的數(shù)據(jù)進(jìn)行全基因組分型，比對至微生物基因組的數(shù)據(jù)，則進(jìn)行微生物組成及豐度分析。

22、優(yōu)選的，所述宿主包括貝類或蝦類。

23、優(yōu)選的，所述宿主包括蝦夷扇貝。

24、本發(fā)明的有益效果：

25、（1）可低成本、高效率的通過單文庫實(shí)現(xiàn)宿主與微生物的聯(lián)合分析：在相同測序深度的情況下，本技術(shù)實(shí)現(xiàn)宿主和微生物聯(lián)合分析的成本約為鳥槍法測序的5%，為擴(kuò)增子測序與全基因組基因分型技術(shù)聯(lián)用的80%。除此之外，本技術(shù)僅需一次取材，一次dna提取，構(gòu)建一個(gè)測序文庫即可實(shí)現(xiàn)宿主及微生物同步聯(lián)合分析；并且所需數(shù)據(jù)量少，對存儲(chǔ)空間及計(jì)算資源占用少，具備標(biāo)準(zhǔn)化分析流程，可實(shí)現(xiàn)較高效率的數(shù)據(jù)分析。

26、（2）可實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)全息組學(xué)的追蹤。本技術(shù)所需dna入口量極低，并且對降解程度較高的dna也仍然適用。因此無需對生物進(jìn)行破壞性取材，即便是對體型較小的某些水產(chǎn)生物而言，通過擦拭組織獲得的材料量即可用于建庫分析。

27、（3）本技術(shù)提取的dna為混合dna，既包含了宿主遺傳信息也同時(shí)包含微生物遺傳信息，因此可獲得不同階段或不同環(huán)境下宿主與微生物dna的相對比例信息。

技術(shù)特征：

1.一種聯(lián)合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述的一種聯(lián)合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，步驟（1）包括：

3.如權(quán)利要求1所述的一種聯(lián)合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，步驟（2）中，所述含有混合dna的材料包括擦拭組織后的棉簽、糞便、腸道或幼蟲材料；所述組織包括鰓絲、外套膜、皮膚或口腔。

4.如權(quán)利要求3所述的一種聯(lián)合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，所述組織為鰓絲或口腔。

5.?如權(quán)利要求1所述的一種聯(lián)合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，步驟（4）中，所述構(gòu)建2brad/miso-rad?測序文庫包括構(gòu)建單標(biāo)簽文庫或構(gòu)建多個(gè)標(biāo)簽串聯(lián)文庫。

6.如權(quán)利要求1所述的一種聯(lián)合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，步驟（4）包括：

7.如權(quán)利要求6所述的一種聯(lián)合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，所述iib型限制性內(nèi)切酶包括alfi、aloi、baei、bcgi、bpli、bsaxi、bslfi、cspci、fali、hin4i或ppii。

8.如權(quán)利要求1所述的一種聯(lián)合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，步驟(5）包括：

9.如權(quán)利要求1~8任一項(xiàng)所述的一種聯(lián)合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，所述宿主包括貝類或蝦類。

10.如權(quán)利要求9所述的一種聯(lián)合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，所述宿主包括蝦夷扇貝。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種聯(lián)合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，步驟如下：構(gòu)建宿主與微生物IIB酶切的全息組學(xué)數(shù)據(jù)庫；選擇合適材料進(jìn)行混合DNA的提取；混合DNA進(jìn)行質(zhì)檢；質(zhì)檢合格后構(gòu)建2b?RAD/多組學(xué)MisoRAD文庫并測序；測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和酶切標(biāo)簽提取后，比對至上述構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫，其中比對至宿主和微生物的數(shù)據(jù)分別采用不同軟件進(jìn)行宿主基因型分析和微生物物種與豐度分析。本發(fā)明可低成本、高效率的在單文庫實(shí)現(xiàn)宿主基因組分型和微生物物種與豐度鑒定的同步聯(lián)合分析；對DNA檢測量要求極低，無需破壞性取樣，可動(dòng)態(tài)追蹤全息組學(xué)的變化。

技術(shù)研發(fā)人員：王師,劉平平,馬岑,徐暢,張?zhí)扃?呂佳,張玲玲,胡景杰,包振民
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國海洋大學(xué)三亞海洋研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9