本發(fā)明屬于細胞生物學，尤其涉及一種檢測細胞穩(wěn)定性的方法。

背景技術：

1、隨著生物技術的進步，基礎科研得到廣泛的關注，尤其在類器官培養(yǎng)、前沿醫(yī)學治療及細胞農(nóng)業(yè)方向得以快速發(fā)展，綜合來講，細胞在體外的應用技術得到廣泛和快速的提升。此外，細胞科學、細胞醫(yī)學及細胞農(nóng)業(yè)相關的研究進一步向細胞改造的方向發(fā)展，隨之帶來的是細胞安全問題的探討和評價，但是，目前以細胞為底盤技術的各個方向的發(fā)展仍然存在著重大挑戰(zhàn)，尤其在細胞體外培養(yǎng)和使用過程中細胞狀態(tài)、細胞異變及細胞穩(wěn)定性等的判斷，導致目前體外細胞使用過程仍然處于高成本、低效率的階段，同時在商業(yè)化使用過程中通過技術手段完成對細胞的評價仍然是一項重大挑戰(zhàn)。

2、除了通過活性檢測查看細胞群體某一個時間點的總體狀況以外，還需要更為綜合的、實時可以實施的、更全面、更深層的評價手段。因此本發(fā)明開發(fā)了針對細胞培育肉用細胞本身穩(wěn)定性和可實時評價、連續(xù)評價、綜合評價的細胞穩(wěn)定性評價方案，包含細胞增殖、細胞遷移、細胞粘附、細胞活力、細胞凋亡、細胞自噬、細胞癌變、細胞衰老等多方面評價因素，可用于細胞連續(xù)傳代、細胞實驗、細胞類器官培養(yǎng)、細胞培育肉及細胞醫(yī)療等過程使用的細胞全面評價技術。

3、因此，細胞穩(wěn)定性評價目前尚未被關注但生命科學研究領域及針對細胞的工業(yè)化應用過程亟須解決的針對培育肉細胞連續(xù)傳代過程中細胞生命活動、功能檢測及穩(wěn)定性評價的技術方案是目前所需要。

技術實現(xiàn)思路

1、為了解決以上技術問題，本發(fā)明提供一種檢測細胞穩(wěn)定性的方法，適用于細胞培育過程中穩(wěn)定性的檢測，主要在細胞使用中對連續(xù)傳代的細胞進行穩(wěn)定性檢測，綜合判斷細胞的生命周期，使細胞應用于最佳經(jīng)濟/效率使用壽命；可以有效、準確評判細胞狀態(tài)，具有良好的可靠性。

2、解決以上技術問題的本發(fā)明中的一種檢測細胞穩(wěn)定性的方法，包括細胞樣品，其特征在于：所述細胞樣品包括經(jīng)細胞功能、細胞異變、細胞穩(wěn)定性能三個方面的檢測，其中當細胞增殖效果良好、細胞不發(fā)生遷移行動、細胞活力>80%、細胞早期及晚期凋亡比例≤10%、細胞自噬比例＜5%、細胞無原癌基因顯著表達、細胞核型分析為染色體數(shù)目和形態(tài)無異變；細胞粘附指標：2h內(nèi)有明顯粘附即可；細胞毒性指標≤10%、細胞衰老比例占比≤20%和細胞倍增時間＜48小時的細胞為穩(wěn)定細胞；若其中一項指標沒有達到標準，則為細胞傳代不穩(wěn)定，中止細胞培育進程。

3、細胞穩(wěn)定性評價的關鍵指標，是衡量細胞培育肉相關細胞使用周期、判斷細胞的最佳經(jīng)濟/效率使用壽命的評判技術，可以在細胞培育肉方向奠定技術基礎，在細胞農(nóng)業(yè)、生物醫(yī)療和基礎研究等領域具有廣闊的應用前景。

4、本發(fā)明中檢測方法可鑒定0-35代或更多代的細胞穩(wěn)定性，篩選穩(wěn)定傳代細胞株以用于細胞培育肉的研發(fā)和優(yōu)化，可為細胞培育肉高效制造奠定技術基礎，可評價細胞使用過程種的經(jīng)濟/效率效價，篩選最優(yōu)使用壽命周期的細胞實現(xiàn)培育肉制造。

5、本發(fā)明中一種檢測細胞穩(wěn)定性的方法，具體步驟如下：

6、（1）獲取細胞樣品：所述細胞為用于細胞培育肉的種子細胞；

7、（2）將細胞進行體外培養(yǎng)；

8、（3）細胞性能的檢測：對細胞增殖、細胞遷移能力或細胞活力等進行檢測，其中細胞增殖效果良好、細胞不發(fā)生遷移行動和細胞活力>80%；整體的細胞增殖、遷移和活力等屬于細胞性能檢測的一部分；

9、或細胞異變的檢測：對細胞凋亡比例、細胞自噬比例或細胞癌變等檢測，其中細胞早期及晚期凋亡比例≤10%、細胞自噬比例＜5%和細胞無原癌基因顯著表達；

10、或細胞穩(wěn)定性能的檢測：對核型分析、細胞粘附、細胞衰老和細胞毒性等檢測：其中細胞核型分析為染色體數(shù)目和形態(tài)無異變；細胞粘附指標：2h內(nèi)有明顯粘附即可；細胞毒性指標≤10%、細胞衰老比例占比≤20%和細胞倍增時間＜48h；

11、細胞穩(wěn)定性能的檢測中也可做細胞組學分析；

12、（4）所述步驟（3）中的指標檢測無先后順序之分，任一指標不達標即可判段該細胞穩(wěn)定性不達標；

13、優(yōu)化方案中，所述細胞樣品包括原代細胞、生物工程改造細胞和永生化細胞等；

14、所述細胞來源包括人、鼠、豬、雞、牛、羊等。

15、進一步驟優(yōu)化方案中，所述步驟（3）細胞穩(wěn)定性能的檢測中，細胞核型分析檢測包括以下步驟：通過秋水仙素進行染色體核型分析測定細胞染色體的異位突變情況，然后將所述細胞與x-gal底物混合進行反應，再通過觀察是否生成深藍色產(chǎn)物判斷細胞是否擁有觀察衰老特異性的β-半乳糖苷酶。

16、所述β-半乳糖苷酶通過催化x-gal顯示生成深藍色產(chǎn)物。

17、所述步驟（3）細胞性能的檢測中，細胞遷移能力測定采用細胞劃痕實驗，通過細胞爬片狀態(tài)判斷細胞遷移能力。

18、所述步驟（3）細胞異變的檢測中，細胞凋亡比例測定采用細胞流式實驗，通過觀察不同代數(shù)細胞凋亡比例進行經(jīng)濟/效率細胞生命周期評價，判斷細胞是否適應規(guī)?；鲋尺^程。

19、所述步驟（3）細胞異變的檢測中，細胞自噬比例測定通過lc3b兔多克隆抗體與吞噬細胞結合產(chǎn)生標記，作為自噬膜的一般標記再通過熒光顯微鏡和高含量成像與分析來判斷細胞自噬情況。

20、所述步驟（3）細胞穩(wěn)定性能的檢測中，細胞粘附性能的測定通過熒光染料鈣黃綠素乙酰氧基甲酯來測量。

21、所述步驟（3）細胞穩(wěn)定性能的檢測中，細胞毒性水平（≤10%）測定通過將所述細胞等份轉(zhuǎn)移到新板中，并添加cyquant??ldh細胞毒性測定試劑盒反應混合物，乳酸脫氫酶(ldh)是一種存在于許多不同細胞類型中的胞質(zhì)酶，質(zhì)膜受損會將ldh釋放到周圍的細胞培養(yǎng)基中，然后培養(yǎng)基中的細胞外ldh可以通過偶聯(lián)酶反應使用酶標儀進行定量，可有效反映細胞毒性水平。

22、本發(fā)明提供以上所述的細胞穩(wěn)定性評價方法在以下任一種中的應用：

23、（1）在細胞連續(xù)傳代過程中的應用；

24、（2）在細胞類器官培養(yǎng)中的應用；

25、（3）在細胞培育肉中的應用；

26、（4）先進細胞醫(yī)學術前安全評價。

27、本發(fā)明中檢測方法解決了目前沒有綜合評價技術和方案的問題，同時對現(xiàn)有判斷方案單一、片面等問題，可作為一種商業(yè)化的細胞評價方案和細胞檢測及評價方法，實現(xiàn)細胞狀態(tài)評估，具有良好的效率和安全性，能夠較好地支持細胞進行相關應用，可在培養(yǎng)皿、生物反應器等多種細胞培養(yǎng)裝置中進行擴增細胞的連續(xù)檢測、綜合評價，可用于細胞連續(xù)傳代、細胞培育肉應用。具體的優(yōu)勢至少包括以下幾方面：

28、（1）本發(fā)明提供的細胞穩(wěn)定性評價方法可直接對細胞狀態(tài)進行全方面的評價，也可通過特定需求增減評價方案，開發(fā)了商業(yè)化的細胞穩(wěn)定性評價新方法；

29、（2）本發(fā)明提供的細胞穩(wěn)定性評價方法能夠最大程度地了解細胞狀態(tài)以及細胞體外應用的三維生長環(huán)境，有利于細胞在體外的培養(yǎng)及應用；

30、（3）本發(fā)明提供的細胞穩(wěn)定性評價方法具有良好的生物安全性，支持細胞增殖、遷移、粘附、活力、凋亡、自噬、癌變、衰老等多方面評價的細胞穩(wěn)定性評價方法，呈現(xiàn)出直觀的細胞狀態(tài)評價；

31、（4）本發(fā)明的細胞穩(wěn)定性評價方法，可有效判斷細胞狀態(tài)是否適合進行細胞的大規(guī)模高效擴增培養(yǎng)，綜合評價細胞成本、時間成本、效率效價等，保障細胞的高效、低成本的商業(yè)運行，同時支持連續(xù)傳代的細胞狀態(tài)需求或進行其他應用；

32、（5）本發(fā)明的細胞穩(wěn)定性評價方法，成本較低，可在生命科學、基礎醫(yī)學及細胞農(nóng)業(yè)領域大規(guī)模推廣應用，有助于提高細胞研究及商業(yè)應用的效率、減少浪費、降低成本。其中，評價方案中的實驗試劑或試劑盒均容易獲取，發(fā)明的思路是目前尚未被提出的；

33、（6）本發(fā)明的細胞穩(wěn)定性評價方法/細胞狀態(tài)評價方案可作商業(yè)使用，其實驗過程簡單、方便，結果準確、有效，優(yōu)勢明顯，便于進行推廣應用。

34、本發(fā)明所述細胞穩(wěn)定性評價方法匯合了目前使用較廣泛的細胞活性檢測方法，并且通過多方面共判斷細胞潛力，結果較準確，具有重要研究意義和應用價值。本發(fā)明在一定程度上可以成為細胞培育肉領域商業(yè)化使用過程中對細胞穩(wěn)定性的評價方案，促進細胞應用效率，提高細胞使用效價。