本發(fā)明屬于膽紅素合成，具體涉及一種全酶催化血紅素合成膽紅素的方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、公開(kāi)該背景技術(shù)部分的信息旨在增加對(duì)本發(fā)明總體背景的理解，而不必然被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

2、膽紅素是人膽汁中的主要色素，具備多種藥理作用，是制造人工牛黃的主要原料。

3、常規(guī)方法生產(chǎn)膽紅素主要以動(dòng)物如豬膽為材料經(jīng)化學(xué)方法提取，由于技術(shù)門檻低，毛利潤(rùn)率極低，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)眾多，且生產(chǎn)過(guò)程用到堿液水解和酸液調(diào)節(jié)ph，廢水量大。目前，膽紅素是來(lái)自膽汁，一公斤膽紅素約需5萬(wàn)個(gè)豬膽，故膽紅素成本較高，因而售價(jià)也高。酶催化生產(chǎn)高純度膽紅素之綜合成本較低，故經(jīng)濟(jì)效益極佳。

4、真核生物通常具有完整的膽紅素合成途徑，該途徑的關(guān)鍵代謝中間體是血紅素，血紅素經(jīng)過(guò)血紅素加氧酶（heme?oxygenase，ho，ec?1.?14.?14.?18）催化開(kāi)環(huán)氧化形成中間產(chǎn)物膽綠素，再經(jīng)過(guò)膽綠素還原酶（biliverdin?reductase，bvr，ec?1.?3.?1.?24）催化的加氫還原形成膽紅素。如閆思翰等構(gòu)建 clostridium?tetani來(lái)源的血紅素加氧酶和谷氨酸脫氫酶輔酶再生系統(tǒng)并進(jìn)行膜表面展示，以 e.?coli全細(xì)胞為催化劑，膽綠素產(chǎn)量達(dá)到76.3?mg/l；jianfeng?mei等以膽綠素為底物，以 e.?coli為宿主表達(dá)藍(lán)藻來(lái)源的膽綠素還原酶作為全細(xì)胞催化劑，膽紅素產(chǎn)量達(dá)到325?mg/l。目前的研究報(bào)道顯示，由血紅素加氧酶催化的血紅素轉(zhuǎn)化速率，遠(yuǎn)低于由膽綠素還原酶催化的膽綠素轉(zhuǎn)化速率，導(dǎo)致難以利用低成本的血紅素為底物進(jìn)行兩步生物催化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種全酶催化血紅素合成膽紅素的方法。血紅素在血紅素加氧酶的作用下轉(zhuǎn)化為膽綠素，膽綠素在膽綠素還原酶的作用下轉(zhuǎn)化為膽紅素。

2、本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述方法合成的膽紅素的應(yīng)用。

3、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

4、一種全酶催化血紅素合成膽紅素的方法，所述方法包括如下步驟：

5、（1）將表達(dá)血紅素加氧酶的畢赤酵母工程菌株進(jìn)行發(fā)酵，將畢赤酵母發(fā)酵液離心，得到菌體沉淀，經(jīng)破碎后得到表達(dá)血紅素加氧酶的畢赤酵母細(xì)胞裂解液；

6、（2）將表達(dá)膽綠素還原酶的大腸桿菌工程菌株進(jìn)行發(fā)酵，將大腸桿菌發(fā)酵液離心，得到菌體沉淀，經(jīng)破碎后得到表達(dá)膽綠素還原酶的大腸桿菌細(xì)胞裂解液；

7、（3）將表達(dá)葡萄糖脫氫酶的大腸桿菌工程菌株進(jìn)行發(fā)酵，將大腸桿菌發(fā)酵液離心，得到菌體沉淀，經(jīng)破碎后得到表達(dá)葡萄糖脫氫酶的大腸桿菌細(xì)胞裂解液；

8、（4）將步驟（1）得到的表達(dá)血紅素加氧酶的畢赤酵母細(xì)胞裂解液，步驟（2）得到的表達(dá)膽綠素還原酶的大腸桿菌細(xì)胞裂解液及步驟（3）得到的表達(dá)葡萄糖脫氫酶的大腸桿菌細(xì)胞裂解液混合，加入葡萄糖溶液和血紅素，進(jìn)行反應(yīng)，得到膽紅素。

9、本發(fā)明以模式菌株 pichia?pastorisgs115為表達(dá)宿主，對(duì)血紅素加氧酶蛋白序列經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化。血紅素加氧酶缺少輔酶結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，無(wú)法直接從nadph中獲取電子和還原力。電子傳遞至底物血紅素的過(guò)程需要氧化還原伴侶蛋白的參與，伴侶蛋白中包含fad、fmn或fe-s簇，并通過(guò)構(gòu)象重排將電子從nadph轉(zhuǎn)移至血紅素分子上。畢赤酵母發(fā)酵合成血紅素加氧酶，同時(shí)畢赤酵母自身可以產(chǎn)生上述輔酶，可以完成反應(yīng)的進(jìn)行，不用再單獨(dú)的合成上述輔酶。

10、本發(fā)明以模式菌株 escherichia?colibl21（de3）為表達(dá)宿主，對(duì)膽綠素還原酶蛋白序列經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化。無(wú)論是血紅素加氧酶還是膽綠素還原酶都需要用到nadph，為了進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，我們?cè)? escherichia?colibl21（de3）工程菌株中表達(dá)了nadp+依賴型的葡萄糖脫氫酶用于輔酶nadph的再生，實(shí)現(xiàn)了在添加極少量輔酶的情況下的高效催化，最后，將畢赤酵母和大腸桿菌細(xì)胞破碎液混合，實(shí)現(xiàn)了高效一步法合成膽紅素，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

11、進(jìn)一步地，步驟（1）中，所述畢赤酵母工程菌株為重組畢赤酵母gs115菌株，所述重組畢赤酵母表達(dá)了來(lái)源于 corynebacterium?diphtheriae的血紅素加氧酶，氨基酸序列如seq?id?no?.1所示：

12、seq?id?no?.1：

13、mttataglavelkqstaqahekaehstfmsdllegrlgvaeftrlqeqawlfytaleqaadavrasgfaeslldpalnraevlardldklndgsewrsritaspavidyvnrleeirdnvdgpalvahhyvrylgdlsggqviarmmqrhygvdpealgfyhfegiaklkvykdeyreklnnlelsdeqrenllkeatdafvfnhqvfadlgkgl。

14、進(jìn)一步地，步驟（1）中，畢赤酵母發(fā)酵液的od600=120-150。

15、所述離心的轉(zhuǎn)速為8000×g，時(shí)間為10?min，溫度為4℃。

16、所述表達(dá)血紅素加氧酶的畢赤酵母工程菌株構(gòu)建方式如下：

17、根據(jù)血紅素加氧酶的氨基酸序列合成血紅素加氧酶基因序列；所述血紅素加氧酶的氨基酸序列如seq?id?no?.1所示；將上述血紅素加氧酶基因序列插入至ppic9k，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒ppic9k-cd，轉(zhuǎn)入畢赤酵母 pichia?pastorigs115內(nèi)，得到所述表達(dá)血紅素加氧酶的畢赤酵母工程菌株。

18、進(jìn)一步地，步驟（1）中，所述發(fā)酵采用如下步驟：

19、將所述畢赤酵母工程菌株接種至ypd液體培養(yǎng)基中，30℃、220?rpm培養(yǎng)16-24?h后，以1％的接種量接種至bmgy液體培養(yǎng)基中，30℃、220?rpm培養(yǎng)至od600達(dá)到1-3，轉(zhuǎn)接至bmmy液體培養(yǎng)基，添加甲醇，于30℃下培養(yǎng)120?h，得到所述發(fā)酵液。

20、進(jìn)一步地，步驟（2）中，所述大腸桿菌工程菌株是以 e.?colibl21（de3）為膽綠素還原酶的表達(dá)宿主，所述大腸桿菌工程菌株表達(dá)了來(lái)源于 castor?canadensis的膽綠素還原酶，氨基酸序列如seq?id?no?.2所示：

21、seq?id?no?.2：

22、mntepgrkfgvvvvgvgragsvrirdlrnphassaflnligfvsrrelgsvdevqqislenalssqeidvayicsessshedyirqflhagkhvlveypmtlslaaaeelwelaeekgkvlheehvellmeeftflkkevvgkellkgsllftagpleeehfgfpafsgisrltwlvslfgelslvsatleekkedqymkmtvhletknkcplswieekgpglkrnrylsfhfksgslenvpnvgvnkniflkdqnifvqkllgqvpekelaaerkrilhclalaeeiqkhcrptk。

23、進(jìn)一步地，步驟（2）中，所述大腸桿菌發(fā)酵液的od600=80-100。

24、所述離心的轉(zhuǎn)速為8000×g，時(shí)間為10?min，溫度為4℃。

25、所述表達(dá)膽綠素還原酶的大腸桿菌工程菌株構(gòu)建方式如下：

26、根據(jù)膽綠素還原酶的氨基酸序列合成膽綠素還原酶基因序列；所述膽綠素還原酶的氨基酸序列如seq?id?no?.2所示；將所述膽綠素還原酶基因序列插入至pet28a(+)，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒bvr-cc，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 e.?colibl21內(nèi)，得到所述表達(dá)膽綠素還原酶的大腸桿菌工程菌株。

27、進(jìn)一步地，步驟（2）中，所述發(fā)酵采用如下步驟：

28、將所述表達(dá)膽綠素還原酶的大腸桿菌菌株接種至含有kan的lb液體培養(yǎng)基中，37℃、200?rpm培養(yǎng)8-10?h，以1％的接種量將種子液接種至含有kan的lb液體培養(yǎng)基中，37℃、200?rpm培養(yǎng)至od600達(dá)到0.4-0.6，添加異丙基-β-d-硫代半乳糖苷，將溫度調(diào)整至20℃，繼續(xù)培養(yǎng)16?h，得到所述發(fā)酵液。

29、進(jìn)一步地，步驟（3）中，所述大腸桿菌工程菌株是以 e.?colibl21（de3）為膽綠素還原酶的表達(dá)宿主，所述大腸桿菌工程菌株表達(dá)了來(lái)源于 bacillus?megaterium的nadp+依賴型甲酸脫氫酶，氨基酸序列如seq?id?no?.3所示：

30、seq?id?no?.3：

31、mytdlkdkvvvvtggskglgramavrfgqeqskvvvnyrsneeealevkkeieqaggqaiivrgdvtkeedvvnlvetavkefgtldvminnagvenpvpshelslenwnqvidtnltgaflgsreaikyfvendikgnvinmssvhemipwplfvhyaaskggmklmtetlaleyapkgirvnnigpgaidtpinaekfadpeqradvesmipmgyignpeeiasvaaflassqasyvtgitlfadggmtkypsfqagrg。

32、進(jìn)一步地，步驟（3）中，所述大腸桿菌發(fā)酵液的od600=80-100。

33、所述離心的轉(zhuǎn)速為8000×g，時(shí)間為10?min，溫度為4℃。

34、所述表達(dá)葡萄糖脫氫酶的大腸桿菌工程菌株構(gòu)建方式如下：

35、根據(jù)葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列合成葡萄糖脫氫酶基因序列；所述葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列如seq?id?no?.3所示，將所述葡萄糖脫氫酶基因序列插入至pet28a(+)，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒gdh-bm，轉(zhuǎn)入至大腸桿菌 e.?colibl21內(nèi)，得到所述表達(dá)葡萄糖脫氫酶的大腸桿菌工程菌株。

36、進(jìn)一步地，步驟（3）中，所述發(fā)酵采用如下步驟：

37、將所述表達(dá)葡萄糖脫氫酶的大腸桿菌工程菌株接種至含有kan的lb液體培養(yǎng)基中，37℃、200?rpm培養(yǎng)8-10?h，以1％的接種量將種子液接種至含有kan的lb液體培養(yǎng)基中，37℃、200?rpm培養(yǎng)至od600達(dá)到0.4-0.6，添加異丙基-β-d-硫代半乳糖苷，將溫度調(diào)整至20℃，繼續(xù)培養(yǎng)16?h，得到所述發(fā)酵液。

38、本發(fā)明所述高效液相檢測(cè)方法是指檢測(cè)血紅素加氧酶催化的產(chǎn)物膽綠素的含量，或檢測(cè)膽綠素還原酶催化的產(chǎn)物膽紅素的含量。

39、本發(fā)明所述血紅素加氧酶的酶活力是以血紅素為底物進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)hplc檢測(cè)其產(chǎn)物膽綠素峰面積衡量的。所述血紅素加氧酶的篩選是通過(guò)比較酶活力進(jìn)行的。

40、本發(fā)明所述膽綠素還原酶的酶活力是以膽綠素為底物進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)hplc檢測(cè)其產(chǎn)物膽紅素峰面積衡量的。所述膽綠素還原酶的篩選是通過(guò)比較酶活力進(jìn)行的。

41、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述全酶催化體系包含但不限于血紅素300?mg/l，通氣量1?vvm，血紅素預(yù)溶于總反應(yīng)體積10％的naoh溶液（0.05m）中，用10?g/l的葡萄糖溶液（ph?7?.5）補(bǔ)齊反應(yīng)體積，反應(yīng)時(shí)間為1?h，反應(yīng)溫度37℃。

42、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述是全酶催化劑的獲得，是將重組酵母菌培養(yǎng)后誘導(dǎo)其表達(dá)血紅素加氧酶，重組大腸桿菌培養(yǎng)后誘導(dǎo)其表達(dá)膽綠素還原酶或葡萄糖脫氫酶，進(jìn)一步收集重組菌菌體后破碎得到。

43、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述是全酶催化劑的獲得，是將表達(dá)血紅素加氧酶的重組畢赤酵母菌按1％接種量到100?ml?ypd培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，當(dāng)od600達(dá)到1～3后，轉(zhuǎn)接bmgy培養(yǎng)基，當(dāng)od600達(dá)到1～3后，離心收集細(xì)胞，轉(zhuǎn)接入bmmy培養(yǎng)基，每天添加0.5%甲醇誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，30℃誘導(dǎo)120h后，8?,000×g低溫離心10min，收集菌體，用20?mm?tris-hcl(ph?7?.5)緩沖液洗兩遍菌體即得。

44、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述是全酶催化劑的獲得，是將表達(dá)膽綠素還原酶和葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌分別按1％接種量到100ml?lb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，當(dāng)od600達(dá)到0?.4～0?.6，加入0?.5mm?iptg誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，20℃誘導(dǎo)16h后，8?,000×g低溫離心10min，收集菌體，用20mm?tris-hcl(ph?7?.5)緩沖液洗兩遍菌體即得。

45、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述全細(xì)胞催化的反應(yīng)條件為：攪拌轉(zhuǎn)速220?r/min，溫度37℃，ph?7.5，通氣量10?vvm，反應(yīng)時(shí)間1～3?h。

46、在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，血紅素的添加量為：0.5～4?mm（合325～2604?mg/l），所述催化劑的添加量：10～40?g/l。

47、上述方法合成的膽紅素在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。

48、有益效果：（1）本發(fā)明成功篩選到了高活力的血紅素加氧酶和膽綠素還原酶，分別在畢赤酵母和大腸桿菌表達(dá)，酵母表達(dá)血紅素加氧酶后，利用自身產(chǎn)生的氧化還原伴侶蛋白fad、fmn或fe-s簇；大腸桿菌分別表達(dá)膽綠素還原酶和葡萄糖脫氫酶，三種酶混合后成功實(shí)現(xiàn)了全酶的血紅素降解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，同時(shí)只需添加少量nadp和葡萄糖，即可達(dá)到高催化活力，催化過(guò)程中無(wú)中間產(chǎn)物膽綠素的積累；以血紅素為底物，經(jīng)過(guò)多酶一鍋級(jí)聯(lián)催化，膽紅素最終產(chǎn)量可達(dá)300mg/l。

49、（2）本發(fā)明建立的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系，解決了傳統(tǒng)的生物組織提取法生產(chǎn)膽紅素的過(guò)程中步驟繁瑣、得率低、廢水排放大等問(wèn)題，具有良好的原子經(jīng)濟(jì)性，實(shí)現(xiàn)了以血紅素為底物，高效綠色合成膽紅素，根據(jù)目前所有數(shù)據(jù)資料顯示本發(fā)明中的膽紅素產(chǎn)量為生物法合成的最高水平。