專利名稱:一種低溫果膠酶菌株、低溫果膠酶及其生產(chǎn)方法
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及微生物及微生物發(fā)酵領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生低溫果膠酶的酵母菌株、低溫果膠酶及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
果膠質(zhì)是植物體細胞壁的主要成分，也是細胞間層的填充劑，約占植物體的20～30％。主要是以α-1，4-糖苷鍵聚合的D-半乳糖醛酸直鏈高分子化合物為主，其直鏈兩側(cè)有羥基和羧基，可與半纖維素、纖維素等結(jié)合或甲基化，形成復(fù)雜、穩(wěn)定的高分子化合物，對細胞起到粘聯(lián)的作用，其一旦分解，植物組織將分散。因此，果膠質(zhì)對植物體形態(tài)與結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用。
果膠酶(Pactinase，E.C.3.2.1.15 )是一類能夠分解果膠質(zhì)的復(fù)合酶的總稱。最早在植物病原菌中發(fā)現(xiàn)，后在植物和多種微生物中均發(fā)現(xiàn)果膠酶的存在，隨著物種的不同，所產(chǎn)生的酶的種類和特性存在較大差異，每一菌種均能產(chǎn)生多種不同組分的果膠酶，如原果膠酶、果膠裂解酶(PL)、內(nèi)聚半乳糖醛酸酶(Endo-PG)、外聚半乳糖醛酸酶(EX-PG)、果膠酯酶(PE)等，每一種果膠酶組分在酶學(xué)特性上也存在較大的差異性。
果膠酶是一種重要的酶制劑，是世界四大酶種之一。在國外，果膠酶制劑很早就被用于生產(chǎn)和生活，我國于1986年才在桔子脫皮工藝上首次使用。目前，果膠酶已在以下果蔬加工及釀造行業(yè)、麻品加工及棉纖維精加工、洗滌、飼料用酶、植物體有機物的制取等行業(yè)得到廣泛的運用。同時，我國也是果膠酶生產(chǎn)的主要國家之一。
果膠酶依據(jù)其最適酶解溫度的差異可分為高溫果膠酶和常溫果膠酶。常溫果膠酶的最適酶解溫度在40～45℃，而高溫果膠酶的最適酶解溫度大于60℃。目前，國內(nèi)外從事果膠酶生產(chǎn)及研究以常溫果膠酶和高溫果酶酶為主。其涉及的主要菌種及其產(chǎn)生的果膠酶主要特性如下黑曲霉(Aspergillus niger)6034，該酶酶解最佳作用條件為pH4.2、溫度50℃(錢玉英 李孝輝 沙恩泳 果膠酶高產(chǎn)菌株Aspe-rgillusniger6034的生理生化特性 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報9(4)181-184，1997)；黑曲霉563，該酶酶解最佳作用條件為pH4.0～5.0、溫度50℃(谷海先 王建釀造工業(yè)用果膠酶、纖維素酶生產(chǎn)菌的選育研究 中國釀造2004，112-15)；黑曲霉(陳榮 謝必峰 陳哲超 謝樹森 吳松剛 激光誘變選育果膠酶高產(chǎn)菌株 光子學(xué)報1997/0297-100)；黑曲霉(Aspergillusniger)(李廷生，王平諸 果膠酶高產(chǎn)菌株Aspergillus niger3502的選育鄭州工程學(xué)院學(xué)報2001，0414-16+25)；由拉加茲工業(yè)菌種保藏室提供的黑曲霉經(jīng)誘變處理后得到的MING1.1、MIUG1.16、MIUG1.58和MIUG1.109產(chǎn)生的果膠酶酶解最適條件為pH4.5左右、溫度40℃(欽傳光，丹·娃倫亭娜果膠酶高產(chǎn)菌株Aspergillus niger3502的選育中國釀造2000，0416-17+20)；黑曲霉(Aspergillus niger)SM40-6，該酶酶解最佳條件為pH4.5，溫度50℃(周仕春，邵繼榮 果膠酶SM40-6菌株的選育及其液體發(fā)酵條件 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報1996/0463-68)。
A.niger來源的果膠酶為材料(周立，李建吾 商品果膠酶中endo-PG的分離純化及其部分性質(zhì)研究 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報1995，04446-451)。
炭黑曲霉(Aspergilluscarbonarius)AS3.396，(佘秋生 郭藹 果膠酶G5512菌株深層液體發(fā)酵中試及提取工藝研究光西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)2004，588-91)；炭黑曲霉突變株K-58(專利公開號CN1273273A)。
禾黑芽枝霉突變菌株GBIBU7，經(jīng)測試其產(chǎn)生的果膠酶含有三種組分，分別命名為PI，PII和PIII.測定了果膠酶的三種組分的動力學(xué)參數(shù).其最適反應(yīng)溫度分別為45℃，35℃和45℃，最適pH值分別為4.4，5.0和5.0(巫華美，秦淮 禾黑芽枝霉誘變體果膠酶的分離純化和理化特性 貴州科學(xué) 1997，03163-170；項明巫華美 禾黑芽枝霉及其誘變體的果膠酶生產(chǎn)特性 貴州科學(xué) 1996/0413-19)。
米曲霉(Aspergillus oryzae)野生菌株N328，該菌產(chǎn)生菌的果膠酶酶解最佳作用條件為pH3.6，溫度45℃，(張寧欣，趙學(xué)慧 果膠酶高產(chǎn)菌株選育 微生物學(xué)雜志 1996/031-8)；米曲霉S-48(王成華Asp·oryzaeS-48果膠酶的性質(zhì)和組分 山東化工 1996/0123-26)；優(yōu)于AS.3.396菌株(張玉墀 果膠酶產(chǎn)生菌的選育 食品科學(xué) 1987，0216-20)。
地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)Xg-01，該菌產(chǎn)生菌的果膠酶酶解最佳條件為pH8.0～10，溫度65℃[郭愛蓮 一株產(chǎn)果膠酶菌株Xg-01的鑒定 陜西師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)1996/0274-76；郭愛蓮?fù)跎佥x 產(chǎn)果膠酶芽孢桿菌X_g-01的分離、篩選及發(fā)酵條件的研究 西北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)1997，0153-56；郭愛蓮，張渭 細菌果膠酶菌株Xg-02的選育 中國釀造1997/0421-23]]；吉氏芽孢桿菌(Bacillus gibsonii S-2)，該酶酶解最佳作用條件為pH10.5、溫度60℃(張保國 白志輝 李祖明 張國政 張洪勛 吉氏芽孢桿菌S-2菌株固態(tài)發(fā)酵制備堿性果膠酶 食品科技，2004，128-11)；Bacillus Ep-5，該酶酶解最佳作用條件為pH8.0、溫度60℃，(茆軍 孫建 張志東 唐琦勇 耐熱果膠酶產(chǎn)生菌的分離及酶學(xué)特性研究 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，S130-31)；枯草桿菌(Bacillus subtilis)18，酶最適pH9.0，最適反應(yīng)溫度60℃[章銀梅李心治枯草桿菌(Bacillus subtilis)產(chǎn)果膠酶的研究I.菌種選育、鑒定及其酶學(xué)特征分析工業(yè)微生物2000，0127-29]；Bacillus MHZP 01和MHZP 02(葛菁萍 凌宏志 果膠酶產(chǎn)生菌的分離及培養(yǎng)條件研究 中國生物工程雜志2004，0893-95)；另外，細菌果膠酶產(chǎn)生菌菌種還有枯草芽孢桿菌( Bacillus Subtilis CGMCC NO0213，專利公開號CN1055118C)、枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis CCTCCNO200038，專利公開號CN1366043A)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilusCCTCC NOM203042，專利公開號CN1480529A)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis，專利號US6429000)、Bacillus subtilis(Nasser et al.(993)FEBS335319-326)、Bacillus sp.YA-14 (Kim et al.(1994)Biosci.Biotech.Biochem.58947-949)、Bacillus pumilus(Dave andVaughn(1971)J.Bacteriol.108l66-174)，B.polym-yxa(Nagel andVaughn(1961)Arch.Biochem.Biophys.93344-352)、B.s-tearothermophilus(Karbassi and Vaughn(1980)Can.J.Microbiol.26377-384)、Bacillus sp.(Hasegawa and Nagel(1996)J.Food Sci.31838-845)and Bac-illus sp.RK9(Kelly and Fogarty(1987)Can.J.Microbiol.241164-1172)等，這些菌株產(chǎn)生菌均為堿性、高溫型果膠酶。
放線菌果膠酶產(chǎn)生菌，酶促反應(yīng)最適條件是pH9.6，溫度45℃，其組分E1酶解最佳條件為pH10、溫度40℃(吳瓊，劉自镕放線菌果膠酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)的研究 山東輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報1996/0453-58；吳瓊，劉自镕放線菌果膠酶產(chǎn)酶條件及酶促反應(yīng)條件的研究 工業(yè)微生物1996/0431-35)。
中溫或高溫果膠酶具有酶解反應(yīng)溫度等劣勢，在工業(yè)化應(yīng)用過程中需要的供較高的熱能以達到其最適的應(yīng)用條件。隨著國際生物行業(yè)研究的深入，科學(xué)發(fā)現(xiàn)許多冷適應(yīng)性微生物(適冷菌與嗜冷菌)可產(chǎn)生冷活性酶類，這類酶通常的特性是最適酶解反應(yīng)溫度較低，在低溫條件下酶解活化能較低。因此，冷活性菌在工業(yè)化生產(chǎn)中具的較好的應(yīng)用前景。
近幾年國外開始從事低溫果膠酶產(chǎn)生菌的篩選及酶學(xué)特性的研究工作，其主要的生產(chǎn)菌種及酶學(xué)特性如下酵母菌Cryptococcus aquaticus，Cryptococcus macerans，Cystofilobasidium capitatum，Cystofilobasidium lari-marin，其產(chǎn)生的酶最適酶解溫度40℃，最適pH5.0，主要用于食品加工行業(yè)，(Cold-adapted yeasts as producers ofcold-active polygalacturonases，Springer-Verlag Tokyo，June 2003Volume 7，Number 31431-0651)、酵母菌Cryptococcus cylindricus和Mrakiafrigida，其菌種可在4℃生長，產(chǎn)生的果膠酶在4℃下具有酶活性，可用于食品加工行業(yè)(Isolation and characterization of psychrophilicyeasts producing cold-adapted pectinolytie enzymes，PMID91b5700[PubMed-indexed for MEDLINE])。低溫酶類的研究因其在節(jié)能、環(huán)保上的特殊性受到世界科學(xué)家的重視。目前，低溫果膠酶的研究主要仍集中于產(chǎn)生菌種的選育研究?，F(xiàn)有的低溫果膠酶菌種產(chǎn)生菌的低溫果膠酶其最適作用溫仍較高，不能達到的室溫下有較高酶學(xué)特性的要求，或是嗜低溫菌種，發(fā)酵生產(chǎn)低溫果膠酶條件較高苛刻，所產(chǎn)生的低溫果膠酶最適作用過低，熱穩(wěn)定性差，應(yīng)用中需進行降溫控制。我國有關(guān)低溫酶的研究工作剛剛開展，尚未見有關(guān)低溫果膠酶的研究報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
針對國內(nèi)外低溫果膠酶菌種產(chǎn)生菌的低溫果膠酶其最適作用溫仍較高，不能達到的室溫下有較高酶學(xué)特性的要求，或是嗜低溫菌種，發(fā)酵生產(chǎn)低溫果膠酶條件較高苛刻，所產(chǎn)生的低溫果膠酶最適作用過低，熱穩(wěn)定性差，應(yīng)用中需進行降溫控制。本發(fā)明提供一種產(chǎn)生該果膠酶的微生物菌種、低溫果膠酶及生產(chǎn)該低溫果膠酶的方法。所述的低溫果膠酶較常溫果膠酶、高溫果膠酶比較，在較低溫的作用溫度下可發(fā)揮較高的酶解特性。
本發(fā)明提供的一株產(chǎn)低溫果膠酶的菌株，通過在新疆阿勒泰地區(qū)典型的自然低溫環(huán)境的土壤樣本分離、篩選和培養(yǎng)，獲得一批耐低溫的微生物菌株，從中篩選出一株編號為LPLB42的菌株，從而提供了一種低溫果膠酶菌株，其具有生產(chǎn)低溫果膠酶的優(yōu)良特性，經(jīng)微生物學(xué)鑒定，屬于隱球酵母菌屬的指甲隱球酵母菌(Cryptococcus nuiguttulatus)。
本發(fā)明在獲得的指甲隱球酵母菌(Cryptococcus nuiguttulatus)的基礎(chǔ)上，提供了一種低溫果膠酶的生產(chǎn)方法。
同時，本發(fā)明還提供了一種低溫果膠酶，通過利用本發(fā)明的菌株經(jīng)過本發(fā)明確定的具體發(fā)酵方法而獲得。
本發(fā)明提供了一種低溫果膠酶菌株，命名為LPLB42，其能夠以高產(chǎn)率產(chǎn)生低溫果膠酶。該菌株已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100080。保藏日期是2005年9月30日，保藏號是CGMCC.No1472。經(jīng)微生物學(xué)鑒定為指甲隱球酵母菌(Cryptococcus nuiguttulatus)。該菌株生長于MYPG-agar培養(yǎng)基表面，菌落呈乳白色，表面光滑，蠟樣，不透明，有光澤，無絲狀菌絲體，菌落老化后略帶淺紅色。該菌種可在5-35℃及pH3.5-9范圍內(nèi)均可生長；依照伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊第八版，LPLB42菌為隱球酵母菌屬中的成員，定為指甲隱球酵母菌(Cryptococcus nuiguttulatus)。該菌種產(chǎn)生的低溫果膠酶，在pH3.5～7.4，溫度在5～40℃范圍內(nèi)均有酶解特性，其最適酶解條件為20℃、pH5.8。本發(fā)明進一步建立菌種保藏、復(fù)壯及選育的系統(tǒng)工藝流程技術(shù)。
本發(fā)明的低溫果膠酶微生物菌種，其菌學(xué)特性如表1所示。其菌學(xué)特性通過法國梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK32自動鑒定儀測定。其結(jié)果與指甲隱球酵母菌(Cryptococcus nuiguttulatus)相似性達99％。
表1LPLB42菌株生理生化特性




作本發(fā)明低溫果膠酶的產(chǎn)生菌種，既可為本發(fā)明所保護的菌株，也可為自然篩選的原始菌株，或通過自然變異或人工誘導(dǎo)變異的變異菌株，通過本發(fā)明所述的方法，均可實現(xiàn)本發(fā)明所闡述的技術(shù)效果。
作為上述變異菌株的研制方法，包括物理誘變，如紫外線輻射處理、鈷60輻照處理、離子注入處理、激光輻照等各種射線處理；化學(xué)誘變，如亞硝基胍(NTG)、硫酸二乙酯等化學(xué)誘變劑處理，用常規(guī)果膠酶產(chǎn)生菌分離篩選培養(yǎng)基及方法優(yōu)選出生產(chǎn)性能優(yōu)異的菌株。
另外，也可通過分子生物學(xué)技術(shù)，從原始菌株或誘導(dǎo)變異菌種中獲取低溫果膠酶基因，以原菌核微生物，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等、真核微生物，如酵母等，作為基因受體菌，構(gòu)建基因工程生產(chǎn)菌株，也可作為本發(fā)明的低溫果膠酶產(chǎn)生菌種。
作為本發(fā)明的低溫果膠酶產(chǎn)生菌種LPLB42，可采用如下方法對其進行保存、活化與篩選，及其搖瓶發(fā)酵獲得本發(fā)明的低溫果膠酶。
本發(fā)明的低溫果膠酶產(chǎn)生菌LPLB42采用常規(guī)的斜面?zhèn)鞔４娣?，此方法是將本發(fā)明菌種接種于只要適合于酵母菌生長的斜面培養(yǎng)基表面，15～25℃培養(yǎng)3～4天，再于4℃下低溫保藏，可存放3個月?；蚴抢谜婵绽鋬龈稍锓▽⒈景l(fā)明菌種制成干粉菌種，低溫或常溫保藏可達1年以上。
長期保藏的菌種在使用時按如下方法進行活化、篩選。將長期保藏的本發(fā)明菌種接種于MYPG-agar培養(yǎng)基或其它適合于酵母菌生長的培養(yǎng)基表面，15～25℃培養(yǎng)3～4天；其MYPG-agar培養(yǎng)基成分如下麥芽膏3g、酵母膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、瓊脂30g、蒸餾水1000mL。再將其接種于含有0.1％的果膠的MYPG agar培養(yǎng)基表面，15～25℃培養(yǎng)2～3天；加入多糖沉淀劑10％的三甲基溴化銨溶液，靜置。在菌落周圍可形成明顯的透明圈，挑取透明圈與菌落直徑比最大的菌株作為本發(fā)明的實驗菌株。
利用經(jīng)活化篩選出的本發(fā)明的實驗菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)實驗，獲得本發(fā)明的低溫果膠酶。在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，可將斜面菌種直接接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，或是將菌種先進行液體增殖培養(yǎng)，再以5％-15％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)。
作為培養(yǎng)基的營養(yǎng)源，可廣泛使用通常用于培養(yǎng)的營養(yǎng)源。只要是可作為碳源同化的碳化合物或者是含有該碳化合物的，微生物菌種可利用的、適合于發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生果膠酶的碳源即可，例如，可使用葡萄糖、麥芽汁、蔗糖、水解糖、可用的多糖等。本發(fā)明中優(yōu)選葡萄糖和桔皮粉為最優(yōu)碳源。葡萄糖用量為0.2-1.5％、桔皮粉用量為0.5-1.0％。
作為氮源，只要是可作為氮源同化的氮化合物或者是含有該氮化合物的即可，例如，可用銨鹽、硝酸鹽、大豆粉、肉類提取物、玉米浸漬液、玉米漿、酵母膏等。其氮源的選擇和用量，可依據(jù)其它營養(yǎng)源的成分和用量的不同而不同，只要選合于本發(fā)明的低溫果膠酶產(chǎn)生菌的培養(yǎng)及酶的產(chǎn)生即可。在本發(fā)明中，優(yōu)選蛋白胨、酵母膏作為最佳的氮源，用量均在0.1-0.5％。
作為無機鹽類，可適當(dāng)添加磷酸氫氨、磷酸二氫鉀等的磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、錳鹽等的鹽類。培養(yǎng)條件依培養(yǎng)基的組份而多少不同，但只要是適合于菌體培養(yǎng)產(chǎn)的、產(chǎn)生本發(fā)明中的果膠酶的條件即可。
作為產(chǎn)酶促進劑，可適量添加Tween系的表面活性劑、SDS等，添加量適培養(yǎng)基的不同而定，只要適宜促進培養(yǎng)過程產(chǎn)生本發(fā)明的果膠酶即可。
通常，可選擇以下的條件進行培養(yǎng)。即，培養(yǎng)溫度為5～35℃，最好為15～25℃的范圍；培養(yǎng)時間為48～80小時，只要在本發(fā)明的低溫果膠酶的生產(chǎn)量達到最高時結(jié)束發(fā)酵培養(yǎng)即可；培養(yǎng)基的pH可在3.5～9的生產(chǎn)范圍，特別是在pH5～7范圍更適于本發(fā)明的果膠酶的生產(chǎn)。經(jīng)如上所述的發(fā)酵培養(yǎng)方法，產(chǎn)生本發(fā)明的低溫果膠酶。
從如上所得的培養(yǎng)液中采集低溫果膠酶，可按照通常用于采集細胞外酶的方法，如硫酸銨鹽析、超濾濃縮、冷凍干燥、色譜分離等，由分離、精制而進行，即，本發(fā)明可由下述方法獲得的低溫果膠酶由過濾法或離心分離法從培養(yǎng)液中分離菌體及培養(yǎng)基固形物，得到上清液或濾液，對該些分離液進行或不進行濃縮，添加可溶性鹽類，使酶沉淀的鹽析法；添加親水性的有機溶劑，使酶或夾雜物沉淀的有機溶劑沉淀法；使用離子交換樹脂等的吸附脫離法；凝膠過濾法；添加穩(wěn)定輔助劑或不添加穩(wěn)定輔助劑的噴霧干燥法；單獨或多個組合使用冷凍干燥法等的分離或精制方法。
通過本發(fā)明如上的闡述，得到后面實施例進一步的驗證，得知本發(fā)明低溫果膠酶的酶學(xué)特性。本發(fā)發(fā)明菌株產(chǎn)生的低溫果膠酶最適酶解pH為5.8左右，在pH3.5～7.4范圍內(nèi)均有酶學(xué)活性；在5～40℃范圍內(nèi)均有酶特性，其最適酶解溫度在20℃，在5℃下仍可保持60％左右的相對酶活力；該低溫果膠酶具有較高的熱穩(wěn)定性，在20℃和30℃以下保溫12小時，其酶活性不發(fā)生衰褪，在30℃以下處理36小時仍可保存80％以上的相對酶學(xué)活性。金屬離子對低溫果膠酶的活性具有一定的影響作用，其中Ca2+對具有激活作用，Zn2+、Mg2+、Mn2+對其活性無顯著影響、Cu2+、Hg2+、Fe3+、Ba2+、Fe2+、Pb2+對酶活性具有抑制作用。作用溫度與低溫果膠酶酶活力的關(guān)系；低溫果膠酶熱穩(wěn)定性；低溫果膠酶pH穩(wěn)定性；金屬離子對低溫果膠酶酶活力的影響作用。
通過實施本發(fā)明具體的技術(shù)指標(biāo)，實現(xiàn)本
發(fā)明內(nèi)容
，可以達到以下有益效果。
本發(fā)明的指甲隱球酵母菌(Cryptococcus nuiguttulatus)菌株及在菌學(xué)上來說與其同等的菌株及其變異菌株，可有效地用于產(chǎn)生本發(fā)明的低溫果膠酶。再有，本發(fā)明的優(yōu)點在于，使用所述菌株的制造具有上述性質(zhì)的低溫果膠酶的方法可有效地產(chǎn)生所述的低溫果膠酶。所得的果膠酶酶液的酶活性可達40U/ml。



圖1所示為以本發(fā)明的指甲隱球酵母菌(Cryptococcusnuiguttulatus)PLB42產(chǎn)生的低溫果膠酶反應(yīng)pH和相對酶活性關(guān)系的圖表。
圖2所示為以本發(fā)明的指甲隱球酵母菌(Cryptococcusnuiguttulatus)LPLB42產(chǎn)生的低溫果膠酶反應(yīng)溫度和相對酶活性關(guān)系的圖表。
圖3所示為以本發(fā)明的指甲隱球酵母菌(Cryptococcusnuiguttulatus)LPLB42產(chǎn)生的低溫果膠酶在各溫度下處理殘余酶活性的圖表。
圖4所示為各種金屬離子對本發(fā)明的指甲隱球酵母菌(Cryptococcusnuiguttulatus)LPLB42產(chǎn)生的低溫果膠酶酶活性的影響效果圖。
下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。另外，在下述的說明中，如無特別說明，則％皆指重量寫。
具體實施方式
實施例1低溫果膠酶產(chǎn)生菌(LPLB42)的培養(yǎng)將低溫果膠酶產(chǎn)生菌接種于含有0.1％的果膠的麥芽膏酵母膏蛋白胨葡萄糖瓊脂(MYPG agar)培養(yǎng)基上，其成分為麥芽膏3g、酵母膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、瓊脂30g、蒸餾水1000mL，將各成分在水中溶化后分裝，10磅滅菌15分鐘。15～25℃培養(yǎng)1～3天，加入多糖沉淀劑，10％的三甲基溴化銨溶液，靜置。在菌落周圍可形成明顯的透明圈。
實施例2低溫果膠酶產(chǎn)生菌(LPLB42菌株)的發(fā)酵培養(yǎng)-I
將桔皮粉1％、磷酸氫二鉀0.2％、磷酸二氫鉀0.05％、氯化鈣0.1％、蛋白胨0.5％、酵母膏0.5％及葡萄糖1.5％的液體培養(yǎng)基100ml裝入500mL錐形瓶中，在121℃作高壓蒸汽滅菌20分鐘后。將經(jīng)活化培養(yǎng)的本發(fā)明的實驗菌株接種于上述培養(yǎng)基中，在20℃，于150rpm下振蕩培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)后，經(jīng)離心分離，獲得低溫果膠酶粗酶液。所得的果膠酶酶液的低溫果膠酶活性為14U/ml。
實施例3低溫果膠酶產(chǎn)生菌(LPLB42菌株)的發(fā)酵培養(yǎng)-II指甲隱球酵母菌(Cryptococcus nuiguttulatus)LPLB42菌株的發(fā)酵培養(yǎng)。
將低溫果膠酶產(chǎn)生菌LPLB42接種于MYPG培養(yǎng)基中。MYPG培養(yǎng)基如下麥芽膏3g、酵母膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、蒸餾水1000mL，將各成分在水中溶化后分裝，10磅滅菌15分鐘。20℃、150rpm，培養(yǎng)36小時后，將培養(yǎng)物以15％的比例加入到如下發(fā)酵培養(yǎng)基中。
桔皮粉1％、磷酸氫二鉀0.2％、磷酸二氫鉀0.05％、氯化鈣0.1％、葡萄糖1.5％、蛋白胨0.5％、酵母膏0.5％及SDS0.4％的液體培養(yǎng)基100ml裝入500mL錐形瓶中，在121℃作高壓蒸汽滅菌20分鐘后。在20℃，于200rpm下振蕩培養(yǎng)80小時。培養(yǎng)后，離心分離去除菌體，得到低溫果膠酶粗酶液。所得的果膠酶酶液的低溫果膠酶活性可達為40U/ml。
從如此所得的果膠酶液中，由硫酸按沉淀法得到65％飽和部分的沉淀。再以通常的方法脫鹽后，冷凍干燥得低溫果膠酶的原粉。
實施例4酶活性的測量方法低溫果膠酶活力測定方法參照《中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》食品添加劑果膠酶制劑(QB1502-1992)標(biāo)準(zhǔn)測定方法。具體測定方法如下于甲乙兩支比色管中，分別加入10g/L果膠溶液(用Sigma公司出品的桔子果膠標(biāo)準(zhǔn)品制劑制備)5mL，在25±0.2℃水浴中預(yù)熱5min。向甲管(空白)中加入0.02M磷酸鹽緩沖液(pH＝5.5)5mL；向乙管(樣品)中加入稀釋酶液1mL、0.02M磷酸鹽緩沖液(pH＝5.5)4mL，立即搖勻，計時；在此溫度下準(zhǔn)確反應(yīng)0.5h，立即取出并加熱煮沸5min終止反應(yīng)，冷卻。取上述甲、乙管反應(yīng)液各5mL放入碘量瓶中，準(zhǔn)確加入1M碳酸鈉溶液1mL、0.1M碘液5mL，搖勻，于暗放置20min；取出，加入2M硫酸溶液2mL，用0.05M硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液滴定至淺黃色，加入淀粉指示液3滴，繼續(xù)加滴定至藍色剛好消失為終點，記錄甲管(空白)、乙管(樣品)反應(yīng)液消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。同時作平行樣品的測定。
測定結(jié)果計算如下X=(A-B)×C×0.51×194.14×N×105×1×0.5]]>式中X-樣品酶活力，u/mL；A-空白消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；B-樣品消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；C-代表硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol.L；0.51-1毫摩爾硫代硫酸鈉相當(dāng)于0.51毫摩爾的游離半乳糖醛酸；
194.14-半乳糖醛酸毫摩爾質(zhì)量，mg；N-酶液稀釋倍數(shù)；10-反應(yīng)總體積；5-滴定時取反應(yīng)混合物的體積，mL；1-反應(yīng)時國入稀釋酶液的體積，mL；0.5-反應(yīng)時間，h。
實施例5作用pH對低溫果膠酶酶活力的影響作用pH和最佳pH以10％的果膠酶溶液(Sigma公司出品的桔子果膠標(biāo)準(zhǔn)品配制)為基質(zhì)，按前述的活性測試方法進行測定。測定的pH分別為3.5～8.0范圍內(nèi)的不同的pH值。以測定的最高酶活力為對照，設(shè)定其相對酶活力為100％。作用pH與酶活性的關(guān)系如圖1所示。本發(fā)發(fā)明菌株產(chǎn)生的低溫果膠酶最適酶解pH為5.8，在pH3.7～6.4范圍內(nèi)可保持較高的酶學(xué)活性。
實施例6作用溫度與低溫果膠酶酶活力的關(guān)系作用溫度及最佳溫度以10％的果膠酶溶液(Sigma公司出品的桔子果膠標(biāo)準(zhǔn)品配制)為基質(zhì)，其它與前述的活性測定方法相同，在5～40℃的范圍內(nèi)的不同的反應(yīng)溫度下進行測試，以酶活力最高的溫度為基準(zhǔn)，設(shè)定相對酶活力為100％。反應(yīng)溫度和相對酶活性的關(guān)系如圖2所示。在5～40℃的溫度范圍內(nèi)測定時，本發(fā)明的低溫果膠酶均呈現(xiàn)酶學(xué)活性，其最佳溫度為20℃。在10～40℃的測定溫度范圍內(nèi)具有良好的酶學(xué)特性。在5℃時仍可保持60％的相對酶學(xué)活性。
實施例7低溫果膠酶熱穩(wěn)定性將低溫果膠酶酶液分別在20℃、30℃、40℃下保溫72小時處理，在不同的時間取樣，按上述酶活性測定方法對其殘余酶活力進行測定，以未經(jīng)保溫處理的酶液為對照，其相對酶活力為100％。測定條件為pH5.7、20℃。此時的處理溫度和殘余活性的關(guān)系如圖3所示。本發(fā)明的LPLB42菌株產(chǎn)生的低溫果膠酶具有較高的熱穩(wěn)性。在20℃和30℃保溫處理12小時，其酶學(xué)活性基本不發(fā)生改變；在30℃以下處理36小時仍可保存80％以上的相對酶學(xué)活性。
實施例8金屬離子對低溫果膠酶酶活力的影響作用金屬離子對低溫果膠酶的影響作用按上述酶活性測定法，在pH＝5.7的磷酸緩沖液中添加Ca2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+、Ba2+、Pb2+、Fe2+，使其終濃度達到0.02M。按上述測定方法對酶活性進行測定。以未加金屬離子的處理為對照，設(shè)定其相對酶活力為100％。金屬離子對酶活力的影響作用如圖4所示。Ca2+對本發(fā)明的低溫果膠酶具有激活作用，Cu2+、Hg2+、Fe3+、Fe2+、Ba2+、Pb2+對酶活性具有不同程度的抑制作用，其余金屬離子對低溫果膠酶無明顯的激活或抑制作用。
權(quán)利要求
1.一種具有產(chǎn)生低溫果膠酶能力的指甲隱球酵母菌株(Cryptococcusnuiguttulatus)CGMCC.No.1472。
2.一種低溫果膠酶的生產(chǎn)方法，其包括，A對指甲隱球酵母菌(Cryptococcus nuiguttulatus)CGMCC.No.1472進行菌種活化培養(yǎng)步驟；B利用步驟A獲得的活化菌種進行發(fā)酵步驟。
3.如權(quán)利要求
2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)基中，最優(yōu)碳源為葡萄糖、桔皮粉；最佳的氮源為優(yōu)選蛋白胨、酵母膏；其中，葡萄糖使用量為0.2-1.5％，桔皮粉使用量為0.5-1.0％，酵母膏與蛋白胨使用量均在0.1-0.5％。
4.如權(quán)利要求
2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵步驟中，接種量為1％-15％，發(fā)酵溫度5℃-35℃、生長pH范圍為3.5-9、轉(zhuǎn)速為150-200rpm、發(fā)酵周期48-80小時。
5.如權(quán)利要求
3所述的生產(chǎn)方法，其特征在于發(fā)酵中，最適發(fā)酵培養(yǎng)溫度為15-25℃，pH最適生長范圍為5-7。
6.一種低溫果膠酶，其利用權(quán)利要求
1所述的指甲隱球酵母菌(Cryptococcus nuiguttulatus)CGMCC.No.1472，由權(quán)利要求
2所述的生產(chǎn)方法制備而成。
7.如權(quán)利要求
6所述的低溫果膠酶，其特征在于，該低溫果膠酶具有高的熱穩(wěn)定性，在5℃-40℃范圍內(nèi)均有酶學(xué)活性，并在5℃下仍可保持60％的相對酶活性，在30℃以下保溫12小時，其酶活性不發(fā)生衰褪；在20℃和30℃以下保溫12小時，其酶活性不發(fā)生衰褪，在pH3.5-7.4范圍內(nèi)均有酶學(xué)活性，酶活達14u/ml～40u/ml。
8.如權(quán)利要求
7所述的低溫果膠酶，其特征在于，最適酶解溫度為20℃，最適酶解pH5.8。
9.如權(quán)利要求
7所述的低溫果膠酶，其特征在于，金屬離子對低溫果膠酶的活性有影響作用，其中Ca2+對具有激活作用、Cu2+、Hg2+、Fe3+、Ba2+、Fe2+、Pb2+對其酶學(xué)活性具有抑制作用。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)生低溫果膠酶的指甲隱球酵母菌(Cryptococcus nuiguttulatus)和利用此菌株生產(chǎn)低溫果膠酶的生產(chǎn)方法，同時還提供了低溫果膠酶。通過利用指甲隱球酵母菌(CGMCC.No.1472)，建立菌種保藏、復(fù)壯及選育的系統(tǒng)方法，經(jīng)過培養(yǎng)基配方優(yōu)化篩選及發(fā)酵工藝條件優(yōu)化控制，確立了穩(wěn)定的發(fā)酵方法，生產(chǎn)的低溫果膠酶具有良好的低溫活性、高酶活?？蓮V泛用于果蔬加工及釀造行業(yè)、麻品加工及棉纖維精加工、洗滌、飼料用酶、植物體有機物的制取等行業(yè)，并具有重要意義。
文檔編號C12N9/24GKCN1952110SQ200510118203
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月19日
發(fā)明者茆軍, 孫建, 馮懷蓉, 王偉, 張志東, 唐琦勇, 婁愷, 魏東, 石玉湖, 閆論, 王宏 申請人:新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan