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基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗及其工作方法

文檔序號:66051閱讀:503來源:國知局
專利名稱:基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗及其工作方法
基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗及其工作方法 (-)技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明 屬于生物用膜片鉗技術(shù)領(lǐng)域
,特別是指一種基于掃描納米玻璃探針顯微鏡 技術(shù)的探測活體細(xì)胞膜表面離子通道活性的高分辨率膜片鉗技術(shù),即一種基于掃描探針顯 微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗及其工作方法。
背景技術(shù)
電生理學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展從一開始就與電子儀器的革新與進(jìn)步緊密相連,儀器設(shè) 備靈敏度和分辨率的提高為深入探知生物電本質(zhì)創(chuàng)造了條件。1976年德國馬普研究所的 Erwin Neher 和 Bert Sakmann 博士創(chuàng)建膜片鉗技術(shù)(patch-clamptechniques)以來,它給 電生理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展乃至整個生物學(xué)研究帶來了一場革命,人們因此對離子通道 本質(zhì)的認(rèn)識有了一個質(zhì)的飛躍。這一偉大的貢獻(xiàn)使Neher和Sakmarm獲得了 1991年度的 諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎。膜片鉗技術(shù)的發(fā)展對離子通道的功能及細(xì)胞功能的調(diào)控研究起到 了巨大的推動作用,其為闡明離子通道病的發(fā)病機(jī)理并探索治療的新途徑提供了有效的研 究方法。然而,任何技術(shù)與方法都不是盡善盡美的,膜片鉗技術(shù)自發(fā)明伊始就從未停止過被 改進(jìn)和完善。根據(jù)特定的試驗(yàn)條件又發(fā)展出了多種模式的膜片鉗技術(shù),從而保證了該技術(shù) 可用于多種細(xì)胞功能的研究?,F(xiàn)在,每年都有數(shù)千篇膜片鉗技術(shù)方法及其應(yīng)用方面的文獻(xiàn) 報道,該技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域里的廣泛應(yīng)用已成為現(xiàn)代生物學(xué)的主要內(nèi)容之一。大量的膜片 鉗技術(shù)研究結(jié)果表明大量的膜片鉗技術(shù)研究結(jié)果表明細(xì)胞膜的離子通道并不是均一分 布的,而是通常分布在細(xì)胞表面的微觀結(jié)構(gòu)中,離子通道的這種分布方式與細(xì)胞生理功能 緊密相連。如具有保鈉排鉀功能的腎上皮細(xì)胞,其特異性咪吡嗪敏感的上皮細(xì)胞Na+通道和 電壓敏感型K+通道多分布在約100納米大小的微絨毛上。離子通道與細(xì)胞表面亞細(xì)胞微 觀結(jié)構(gòu)及其生理功能緊密相關(guān)的現(xiàn)實(shí),向傳統(tǒng)的膜片鉗技術(shù)發(fā)起了新的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的膜片 鉗技術(shù)須先借助光學(xué)顯微鏡來在細(xì)胞膜表面進(jìn)行玻璃微電極針尖定位后再進(jìn)行離子通道 的記錄,由于光學(xué)衍射極限的限制使普通光學(xué)顯微鏡的最高分辨率很難突破200納米,導(dǎo) 致傳統(tǒng)的膜片鉗技術(shù)不能準(zhǔn)確研究離子通道與小于200納米的細(xì)胞表面微結(jié)構(gòu)的關(guān)系。加 之,許多生物樣品的光透過性不好,這更加降低了傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)的分辨率。因此,低分辨 率的傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)已不能滿足目前生物學(xué)研究的需要。
隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展及掃描探針顯微鏡技術(shù)(SPM)在生物領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用, 使高分辨率地實(shí)時探測活體生物樣品成為可能。1989年,加州大學(xué)的Hansma教授利用掃 描探針顯微鏡的負(fù)反饋控制技術(shù),用玻璃微探針作為掃描探針設(shè)計出了非接觸式的掃描離 子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)(scanning ion conductance microscopy, SICM)(見圖 1)。但是由于 當(dāng)時負(fù)反饋控制方法及精確定位技術(shù)的局限與不足,纖細(xì)的玻璃微滴管探針在掃描時經(jīng)常 意外地與樣品表面接觸并導(dǎo)致針尖或樣品的毀損,所以掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)在其發(fā)明 后的很長一段時間僅適用于平坦的PET薄膜的掃描成像。1997年英國倫敦帝國理工學(xué)院 的Korchev教授對掃描離子電導(dǎo)探針顯微鏡的負(fù)反饋控制等技術(shù)進(jìn)行重大改進(jìn)后,使該顯 微鏡技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對活體生物樣品表面結(jié)構(gòu)的非接觸三維實(shí)時探測,并逐步成為納米生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域具有發(fā)展?jié)摿皯?yīng)用前景的一種掃描納米玻璃探針顯微鏡技術(shù)。SICM可以實(shí)時 高分辨率地非接觸式探測活體生物樣品表面形貌,其納米尺度玻璃微滴管掃描探針與膜片 鉗用玻璃微電極相似且同樣在電解液中工作,因此為建立高分辨率的膜片鉗技術(shù)提供了技 術(shù)保障。

發(fā)明內(nèi)容
本 發(fā)明的目的在于提供一種基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗及其工 作方法,它針對傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)分辨率的不足,提供了一種利用掃描探針顯微鏡非接觸式 掃描的高分辨率來精確定位膜片鉗玻璃微滴管電極,建立了一種基于非接觸掃描探針顯微 鏡掃描控制技術(shù)的高分辨率膜片鉗技術(shù),從而為研究細(xì)胞膜表面納米尺度微觀結(jié)構(gòu)與特定 生理功能(離子通道特性)的關(guān)系提供了全新技術(shù)手段。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗,其特征在 于它包括充滿電解液的玻璃微探針、置于玻璃微探針內(nèi)的Ag/AgCl電極、參比Ag/AgCl電 極、內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿、SICM樣品掃描臺、SICM負(fù)反饋掃描控制電路、SICM高 精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺、商用膜片鉗前置電流功率放大器及膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換 器;所說的充滿電解液的玻璃微探針和參比Ag/AgCl電極均置于培養(yǎng)皿的細(xì)胞培養(yǎng)液中; 所說的置于玻璃微探針內(nèi)的Ag/AgCl電極和參比Ag/AgCl電極分別與膜片鉗前置電流功率 放大器連接;所說的膜片鉗前置電流功率放大器與膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器連接;所說的 膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器與SICM負(fù)反饋掃描控制電路連接;所說SICM負(fù)反饋掃描控制電 路與SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺;所說的內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿置于 SICM樣品掃描臺上。
上述所說的膜片鉗前置電流功率放大器采用美國Molecular Device公司的Axon 商用膜片鉗技術(shù)。
上述所說的膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器采用美國Molecular Device公司的Axon商 用膜片鉗技術(shù)。
上述所說的SICM負(fù)反饋控制電路采用英國I0NSC0PE公司的ICnano SICM非接觸 式掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)。
上述所說的SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺采用英國I0NSC0PE公司的 ICnano SICM非接觸式掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)。
一種基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗的工作方法,其特征在于它由以 下步驟構(gòu)成
(1)用SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺及SICM負(fù)反饋掃描控制電路控制玻 璃微探針在細(xì)胞表面非接觸地掃描并獲得細(xì)胞膜表面的高分辨率成像;
(2)在SICM負(fù)反饋掃描控制電路的作用下膜片鉗玻璃微探針非接觸地精確定位 于樣品表面待研究的特定納米尺度微結(jié)構(gòu)上;
(3)關(guān)閉SICM負(fù)反饋掃描控制電路,再像傳統(tǒng)膜片鉗一樣完成玻璃微探針與細(xì)胞 膜片接觸并形成兆歐姆封接;
(4)細(xì)胞膜片上的離子通道電流通過膜片鉗前置電流功率放大器放大、膜片鉗數(shù) 模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器采集,從而實(shí)現(xiàn)離子通道記錄。[0015]本發(fā)明的工作原理Ag/AgCl電極置于充滿電解液的玻璃微探針中作為掃描探 針,內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿置于SICM樣品掃描臺上,參比電極置于培養(yǎng)皿的細(xì)胞 培養(yǎng)液中,并通過負(fù)反饋電路實(shí)時監(jiān)測探針內(nèi)電極與參比電極之間電導(dǎo)的變化。當(dāng)探針接 近細(xì)胞表面時,由于允許離子流入玻璃微探針針尖自由空間的減小,離子電導(dǎo)也隨之減小。 在掃描過程中,SICM負(fù)反饋控制電路通過高精度XYZ三維壓電陶瓷來保持玻璃探針電極與 細(xì)胞表面距離的恒定(即非接觸)。
本發(fā)明的優(yōu)越性本發(fā)明的高分辨率的膜片鉗技術(shù)可被方便地用于研究多種細(xì)胞 膜上納米尺度微結(jié)構(gòu)中離子通道的“開”、“閉”動力學(xué)、離子通透性等,從而為研究細(xì)胞膜表 面納米尺度微觀結(jié)構(gòu)與特定生理功能的關(guān)系提供了全新的技術(shù)手段。


圖1為現(xiàn)有技術(shù)非接觸式的掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為本發(fā)明所涉一種基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗的結(jié)構(gòu)示意 圖。
圖3為本發(fā)明所涉一種基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗的工作流程 圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例我們利用英國I0NSC0PE公司的ICnano SICM非接觸式掃描離子電導(dǎo)顯微 鏡技術(shù)融合美國Molecular Device公司的Axon商用膜片鉗技術(shù),來建立新型的基于非接 觸掃描探針顯微鏡技術(shù)掃描控制技術(shù)的高分辨率膜片鉗。主要用Axon商用膜片鉗系統(tǒng)的 前置電流功率放大器和數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器來替代SICM顯微鏡自有電流放大器(見圖2)。 圖中,Ag/AgCl電極置于充滿電解液的玻璃微探針中作為掃描探針,內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液 的培養(yǎng)皿置于SICM樣品掃描臺上,參比電極置于培養(yǎng)皿的細(xì)胞培養(yǎng)液中,并通過負(fù)反饋電 路實(shí)時監(jiān)測探針內(nèi)電極與參比電極之間電導(dǎo)的變化。當(dāng)探針接近細(xì)胞表面時,由于允許離 子流入玻璃微探針針尖自由空間的減小,離子電導(dǎo)也隨之減小。在掃描過程中,SICM負(fù)反 饋控制電路通過高精度XYZ三維壓電陶瓷來保持玻璃探針電極與細(xì)胞表面距離的恒定(即 非接觸)。
在高分辨率膜片鉗實(shí)施例的具體操作步驟中(見圖3),首先用SICM高精度XYZ三 維壓電陶瓷掃描臺及負(fù)反饋掃描控制系統(tǒng)控制玻璃電極探針在細(xì)胞表面非接觸地掃描并 獲得細(xì)胞膜表面的高分辨率成像;在負(fù)反饋和掃描控制系統(tǒng)幫助下膜片鉗玻璃電極非接觸 精確定位于樣品表面待研究的特定納米尺度微結(jié)構(gòu)上;關(guān)閉負(fù)反饋和掃描控制系統(tǒng),再像 傳統(tǒng)膜片鉗一樣完成玻璃電極與細(xì)胞膜片兆歐姆封接及進(jìn)行離子通道記錄。這種高分辨率 的膜片鉗技術(shù)可被方便地用于研究多種細(xì)胞膜上納米尺度微結(jié)構(gòu)中離子通道的“開”、“閉” 動力學(xué)、離子通透性等,從而為研究細(xì)胞膜表面納米尺度微觀結(jié)構(gòu)與特定生理功能的關(guān)系 提供了全新的技術(shù)手段。
以上所述僅為本發(fā)明基于英國I0NSC0PE公司的ICnano SICM非接觸式掃描離子 電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)融合美國Molecular Device公司的Axon商用膜片鉗技術(shù)所建立的活體細(xì) 胞的高分辨率膜片鉗技術(shù)手段,應(yīng)當(dāng)指出,對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說,依據(jù)本發(fā)明的構(gòu)成方式和操作原理,還可以將其他掃描探針顯微鏡技術(shù)與其他商用膜片鉗系統(tǒng)相結(jié)合而建立 類似的高分辨率膜片鉗系統(tǒng),這些均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗,其特征在于它包括充滿電解液的 玻璃微探針、置于玻璃微探針內(nèi)的Ag/AgCl電極、參比Ag/AgCl電極、內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng) 液的培養(yǎng)皿、SICM樣品掃描臺、SICM負(fù)反饋掃描控制電路、SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷 掃描臺、商用膜片鉗前置電流功率放大器及膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器;所說的充滿電解液 的玻璃微探針和參比Ag/AgCl電極均置于培養(yǎng)皿的細(xì)胞培養(yǎng)液中;所說的置于玻璃微探針 內(nèi)的Ag/AgCl電極和參比Ag/AgCl電極分別與膜片鉗前置電流功率放大器連接;所說的膜 片鉗前置電流功率放大器與膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器連接;所說的膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換 器與SICM負(fù)反饋掃描控制電路連接;所說SICM負(fù)反饋掃描控制電路與SICM高精度XYZ三 維壓電陶瓷掃描臺;所說的內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿置于SICM樣品掃描臺上。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所說的一種基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗,其特征在 于所說的膜片鉗前置電流功率放大器采用美國Molecular Device公司的Axon商用膜片鉗 技術(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所說的一種基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗,其特征在 于所說的膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器采用美國Molecular Device公司的Axon商用膜片鉗技 術(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所說的一種基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗,其特征在 于所說的SICM負(fù)反饋控制電路采用英國I0NSC0PE公司的ICnano SICM非接觸式掃描離子 電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所說的一種基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗,其特征在 于所說的SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺采用英國I0NSC0PE公司的ICnano SICM非 接觸式掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)。
6.一種基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗的工作方法,其特征在于它由以下 步驟構(gòu)成(1)用SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺及SICM負(fù)反饋掃描控制電路控制玻璃微 探針在細(xì)胞表面非接觸地掃描并獲得細(xì)胞膜表面的高分辨率成像;(2)在SICM負(fù)反饋掃描控制電路的作用下膜片鉗玻璃微探針非接觸地精確定位于樣 品表面待研究的特定納米尺度微結(jié)構(gòu)上;(3)關(guān)閉SICM負(fù)反饋掃描控制電路,再像傳統(tǒng)膜片鉗一樣完成玻璃微探針與細(xì)胞膜片 接觸并形成兆歐姆封接;(4)細(xì)胞膜片上的離子通道電流通過膜片鉗前置電流功率放大器放大、膜片鉗數(shù)模/ 模數(shù)轉(zhuǎn)換器采集,從而實(shí)現(xiàn)離子通道記錄。
專利摘要
一種基于掃描探針顯微鏡技術(shù)的高分辨率膜片鉗,包括充滿電解液的玻璃微探針、置于玻璃微探針內(nèi)的Ag/AgCl電極、參比Ag/AgCl電極、內(nèi)含細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿、SICM樣品掃描臺、SICM負(fù)反饋掃描控制電路、SICM高精度XYZ三維壓電陶瓷掃描臺、商用膜片鉗前置電流功率放大器及膜片鉗數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器;工作方法為玻璃微探針在細(xì)胞表面非接觸地掃描并獲得細(xì)胞膜表面的高分辨率成像;膜片鉗玻璃微探針非接觸精確定位于樣品表面待研究的特定納米尺度微結(jié)構(gòu)上;完成玻璃微探針與細(xì)胞膜片兆歐姆封接,從而實(shí)現(xiàn)離子通道記錄。優(yōu)越性高分辨率的膜片鉗技術(shù)可用于研究多種細(xì)胞膜上納米尺度微結(jié)構(gòu)中離子通道的“開”、“閉”動力學(xué)、離子通透性等。
文檔編號G01Q10/04GKCN102071135SQ200910228604
公開日2011年5月25日 申請日期2009年11月20日
發(fā)明者張彥軍 申請人:國家納米技術(shù)與工程研究院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan
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