專利名稱：:一種修復多環(huán)芳烴污染場地的混合菌劑及制備方法和應用方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種用于治理環(huán)境中多環(huán)芳烴的混合菌劑及其應用方法，屬于有機污染場地的生物修復領域。技術背景多環(huán)芳烴(PAHs)是一種在環(huán)境中普遍存在的持久性有機污染物，因其具有致癌、致畸、致突變的毒性效應，對人類健康和生態(tài)環(huán)境均具有潛在的危險。美國環(huán)保局和歐共體以將其列為優(yōu)先控制的污染物，并把PAHs的16種化合物作為環(huán)境污染的監(jiān)測參數。多環(huán)芳烴類化合物具有極低的水溶性，常規(guī)方法難以將其從環(huán)境中去除。微生物修復技術被認為是降解多環(huán)芳烴污染環(huán)境治理的重要手段之一。迄今為止，現有降解多環(huán)芳烴的微生物方法多是以單一或低環(huán)或高環(huán)的多環(huán)芳烴類化合物為目標降解物。經國家知識產權局專利檢索系統檢索結果表明，至2009年11月30日止，降解多環(huán)芳烴的微生物菌劑的專利有io項，其中多環(huán)芳烴厭氧降解的專利有兩項，其他為好氧降解菌劑。多環(huán)芳烴厭氧降解純菌種的分離純化方法與應用(公開號CN101195811)中，采用假單胞菌對萘、菲、芘、芴等有顯著厭氧降解效果。多環(huán)芳烴厭氧降解混合菌群的富集與馴化刪選方法及應用(公開號CN101440354)中，20_25d后，對萘、菲、芘、芴的降解速率范圍為0.01-1.04mgL—1d—、一種多環(huán)芳烴高效降解菌系及其應用(公開號CN101196810)中，7d后GP3混合菌系對芘的降解率為75.7-99.5%。一種多環(huán)芳烴降解菌及其應用(公開號CN1844361A)中，鞘氨醇單胞菌屬菌株GY2B對菲的降解速率在36h后為91.7-97.8%。一種用于修復多環(huán)芳烴污染土壤的污泥菌劑的制備方法(公開號CN101302483)中介紹了污泥菌劑的詳細制備過程。一種產生生物乳化劑和降解多環(huán)芳烴的赤紅球菌Em及用途(公開號CN1519312)中，該菌劑對蒽、菲、芘均有降解效果。一種高環(huán)多環(huán)芳烴降解菌及其應用(公開號CN101343616)中，利用宛氏擬青霉菌F6對多環(huán)芳烴單一和混合體系進行降解，3d后。對BkF和BbF的降解率分別為33.25%和22.64%。一種用于多環(huán)芳烴污染土壤修復的固定化細菌制備方法(公開號CN101177679)中，42d后微球菌對Pyr，BAP的降解率分別為30.7%和25.7%;動膠桿菌對Pyr，BAP的降解率分別為31.4%和21.9%。一種利用新微生物菌株降解土壤中多環(huán)芳烴芘的方法(公開號CN101492648)中，利用惡臭假單胞菌新菌株PL2，經過3-10天后，對芘的降解速率為50-70%。一種多環(huán)芳烴降解菌劑的制備方法(公開號CN101423807)中，利用新型菌株Mycobacterium,sp.，經過7天。對芘和菲的降解率分別為91.5%和95.2.由上可知，目前用于多環(huán)芳烴污染修復的菌劑多是利用一到兩種細菌或真菌，針對某一種或低環(huán)或高環(huán)的多環(huán)芳烴進行降解，而實際上工業(yè)污染場地往往都是16種或更多的多環(huán)芳烴同時存在，因此降解效果差。
發(fā)明內容[0005]本發(fā)明的技術解決問題克服現有技術的不足，提供一種用于降解污染場地中各種多環(huán)芳烴污染物的微生物菌劑，利用混合細菌菌株在降解多環(huán)芳烴過程中的相互協同作用以及復合載體的高活性等特點，提高對多環(huán)芳烴污染物的降解效果。本發(fā)明還提供該微生物菌劑的制備和應用方法，包括制備該微生物菌劑所使用的菌種和發(fā)酵方法。本發(fā)明的技術解決方案一種用于多環(huán)芳烴污染土壤和水體的微生物菌劑，是由降解多環(huán)芳烴的細菌按一定比例混合發(fā)酵而得的混合細菌發(fā)酵液與固體載體按質量比0.51:l混合制成。本發(fā)明的微生物菌劑是由Bordetella屬、Ochrobact進屬、Frateuria屬、Rhodococcus屬、Achcromobacter屬、Herbaspirillum屬、Microbacterium屬等的混合細菌發(fā)酵液與復合載體按o.51:l質量比的混合物，混合菌的有效活菌數為io8-io"個/ml。本發(fā)明的微生物菌劑的制備方法，將降解多環(huán)芳烴的Bordetella屬、Ochrobactrum屬、Rhodococcus屬、Achcromobacter屬、Herbaspiri1lum屬、Microbacterium屬細菌的一級種子液按照21101:40200:22102:20100:1:2的體積比混合發(fā)酵，而得的混合細菌發(fā)酵液與固體載體按質量比例0.51:i混合。其中，所述的降解多環(huán)芳烴的混合細菌發(fā)酵液的制備步驟如下[0010](1)菌種來源菌種從焦化工業(yè)污染場地的土壤中以16種單一多環(huán)芳烴為唯一碳源馴化篩選所得，分別為Bordetella屬、0chrobactrum屬、Rhodococcussp屬、Achcromobacter屬、Herbaspirillum屬、Microbacterium屬。[0012](2)—級種子液將上述菌種分別在牛肉青蛋白胨斜面培養(yǎng)基上活化36-48h后，轉接到液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中搖瓶活化36-48h，作為一級種子液。溫度3(TC、轉速150-200轉/min。[0014](3)混合細菌發(fā)酵液將上述各菌種的一級種子液，總接種量2%_10%體積百分比轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基內培養(yǎng)24-48h。發(fā)酵條件為，罐溫30-35。C、罐壓0.02-0.06MPa、通氣量1:1.01.5v/v/min、攪拌速度300轉/min;所述的細菌發(fā)酵液中，混合細菌的有效活菌數為108-10"個/ml。上述步驟3中的發(fā)酵培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。所述的固體載體的制備如下將草炭土、活性炭、鋸末和稻殼風干、研磨，過60目篩，按草炭土50%，活性炭30%，鋸末10%，稻殼10%混合均勻。本發(fā)明的微生物菌劑的應用，在用于多環(huán)芳烴污染的水體和土壤環(huán)境進行降解處理時，還可以添加表面活性劑和水，攪拌均勻，灑在污染場地。上述應用時，微生物菌劑用于存在多環(huán)芳烴污染的土壤和水體中，菌劑按0.42%質量百分比的施用量施入污染介質，添加量也可根據土壤污染的程度進行適當調整。[0020]本發(fā)明與現有技術相比的優(yōu)點在于(1)本發(fā)明將具有多環(huán)芳烴降解能力的細菌分別進行液體純種活化，按同一發(fā)酵條件和同一發(fā)酵培養(yǎng)基內進行混合培養(yǎng)，獲得高活性的細菌發(fā)酵液。4[0022](2)本發(fā)明中采用的復合載體質地疏松，營養(yǎng)豐富，便于微生物吸附和二次增殖，具有很高的生物活性。(3)本發(fā)明選取了針對高環(huán)和低環(huán)多環(huán)芳烴的降解菌，各種細菌的配比依據工業(yè)污染場地中多環(huán)芳烴的組成進行設置，顯著提高了菌劑對目標污染物的降解能力。[0024](4)本發(fā)明提供的固體微生物菌劑具有在土壤中活性高、生長迅速、成本低、對環(huán)境不造成二次污染的特點，便于原位生物修復的應用。圖1為本發(fā)明混合菌劑的制備示意圖。具體實施方式本發(fā)明所述的細菌分離自焦化化工污染場地。[0027]實施例l混合細菌發(fā)酵液的制備采用的細菌為Bordetella屬、Ochrobact:r咖屬、Rhodococcus屬、Achcromobacter屬、Herbaspirillum屬、Microbacterium屬，將其分別經過斜面培養(yǎng)、搖瓶活化培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)得到的細菌發(fā)酵液，具體操作步驟為[0029](1)斜面培養(yǎng)基采用常規(guī)方法制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，具體步驟為牛肉膏2.5g，蛋白胨5g，NaCl5g，蒸餾水1000ml，pH7.2-7.4，瓊脂1.5%_2%攪拌均勻，于121.3"C條件下滅菌25min。滅菌后做成斜面，分別在超凈工作臺上。無菌接種保臧的菌株到斜面試管上，菌種在25-3(TC培養(yǎng)36-48h，待菌苔長滿斜面?zhèn)溆?。[0031](2)種子液的制備液體培養(yǎng)基仍為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，將配制好的液體培養(yǎng)基分裝入150-250ml三角瓶中，裝液量為20-60ml，于121.3。C條件下滅菌30min。待冷卻至4(TC左右，挑取一環(huán)斜面菌苔接種于三角瓶內，然后置于搖床上培養(yǎng)，調整搖床轉速為150-250rpm，25-3(TC培養(yǎng)36-48h，待培養(yǎng)基混濁后裝入發(fā)酵培養(yǎng)基內培養(yǎng)。[0033](3)混合細菌發(fā)酵液的制備將分別活化好的細菌的種子液，按Bordetella屬、Ochrobactrum屬、Rhodococcussp屬、Achcromobacter屬、Herbaspirill咖屬、Microbacterium屬以21:40:22:20:i:2;51:ioo:102:50:i:2;101:200:202:100:1:2的三種比例混合。按照5%-10%(v/v)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基即牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，配方為牛肉膏2.5g，蛋白胨5g，NaCl5g，蒸餾水1000ml，pH7.2_7.4。接種后置于發(fā)酵罐內發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵條件為，罐溫30-35t:、罐壓0.02-0.06MPa、通氣量1:1.01.5v/v/min、攪拌速度300轉/分鐘.此條件下發(fā)酵36_48h，獲得高活性的混合發(fā)酵液。上述三種比例混合細菌的有效活菌數分別為2.09X1011、1.97X1011和1.46X1010個/ml。實施例2液體菌劑的降解效率驗證試驗在4.4mg/L的多環(huán)芳烴液體培養(yǎng)基中，以2%的接種量分別加入實施例所述三種配比的混合細菌液，18d后，總多環(huán)芳烴的降解率分別為49.4%、50.9%和47.4%。[0037]實施例3固體復合菌劑的制備，如圖l所示。[0038](1)復合載體的制備草炭土、活性炭取自北京市北京華力航科技發(fā)展有限公司，稻殼、鋸末取自北京市房山農科所。將以上載體風干，研磨，過60目篩，按草炭土50%，活性炭30%，鋸末10%，稻殼10%，以上載體均風干研磨，過60目篩，混合均勻后滅菌風干備用。[0041](2)混合細菌發(fā)酵液的制備，見實施例1.(3)混合細菌發(fā)酵液與復合載體按質量比0.51:1混合均勻，通風干燥后，混合菌的有效活菌數為108-10"個/克菌劑。實施例4固體復合菌劑的降解效率驗證試驗取某工業(yè)污染場地作為實驗小區(qū)，小區(qū)面積2mX2m，翻土0-40cm，按0.4%的量施加固體菌劑，翻土以混合均勻，并同時設置不施加菌劑作對照，小區(qū)土壤中原始多環(huán)芳烴濃度見表1，30天后，施加菌劑的小區(qū)中多環(huán)芳烴的總降解率為59.68%，對不同種類多環(huán)芳烴的降解率見表l，而空白對照中多環(huán)芳烴的總降解率為32%。[0CH5]表1現場小區(qū)菌劑修復效率(單位mg/kg)[0046]<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>[0047]本發(fā)明未詳細闡述屬于本領域公知技術。權利要求一種用于修復污染場地中多環(huán)芳烴的混合菌劑，其特征在于由混合細菌發(fā)酵液與固體載體混合得到；所述的混合細菌發(fā)酵液是由Bordetella屬、Ochrobactrum屬、Rhodococcus屬、Achcromobacter屬、Herbaspirillum屬和Microbacterium屬按照21～101∶40～200∶22～102∶20～100∶1∶2的體積比混合發(fā)酵而得的菌液；所述固體載體為草炭土、活性炭、鋸末和稻殼按照50％∶30％∶10％∶10％的質量百分比混合均勻而成；所述固體載體為草炭土，活性炭，鋸末和稻殼按照50％∶30％∶10％∶10％質量百分比混合均勻而成；所述多種細菌混合發(fā)酵液與固體載體按質量比0.5～1∶1混合即得固體混合菌劑，混合菌劑的有效活菌數達108-1011個/g。2.—種用于修復污染場地中多環(huán)芳烴的混合菌劑的制備方法，其特征在于將降角牟多環(huán)芳經的Bordetella屬、Ochrobactrum屬、Rhodococcus屬、Achcromobacter屬、Herbaspirillum屬禾口Microbacterium屬細菌的一級禾中子液按照21101:40200:22102:20ioo:i:2的體積比混合發(fā)酵，而得的混合細菌發(fā)酵液與固體載體按質量百分比o.51:i混合，其中，所述的降解多環(huán)芳烴的混合細菌發(fā)酵液的制備步驟如下(1)菌種來源菌種從焦化工業(yè)污染場地的土壤中以16種單一多環(huán)芳烴為唯一碳源馴化篩選所得，分別為Bordetella屬、Ochrobactrum屬、Rhodococcussp屬、Achcromobacter屬、Herbaspirillum屬、Microbacterium屬；(2)—級種子液將上述菌種分別在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上活化36-48h后，轉接到液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中搖瓶活化36-48h，作為一級種子液，溫度3(TC、轉速150-200轉/min;(3)混合細菌發(fā)酵液將上述各菌種的一級種子液，總接種量2%-10%的體積百分比轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基內培養(yǎng)24-48h;發(fā)酵條件為，罐溫30-35。C、罐壓0.02-0.06MPa、通氣量1:1.01.5v/v/min、攪拌速度300轉/min;所述的細菌發(fā)酵液中，混合細菌的有效活菌數為1()8-10"個/g;所述的固體載體的制備如下將草炭土、活性炭、鋸末和稻殼風干、研磨，過60目篩，按草炭土50%，活性炭30%，鋸末10%，稻殼10%的質量百分比混合均勻。3.根據權利要求2所述的一種用于修復污染場地中多環(huán)芳烴的混合菌劑的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的發(fā)酵培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。4.一種用于修復污染場地中多環(huán)芳烴的混合菌劑的應用方法，其特征在于按所述權利要求1得到的混合菌劑的0.42%質量百分比用量施入污染介質，混勻即可起到修復作用，該菌劑可用于污染場地中土壤和水體的多環(huán)芳烴污染修復。專利摘要一種用于污染場地中多環(huán)芳烴降解的混合菌劑及其制備方法，屬于環(huán)境污染修復工程領域。該菌劑所用的菌種是由Bordetella屬、Ochrobactrum屬、Rhodococcus屬、Achcromobacter屬、Herbaspirillum屬和Microbacterium屬按照21～101∶40～200∶22～102∶20～100∶1∶2的比例混合發(fā)酵而得的菌液。該菌液與固體載體按質量比例0.5～1∶1混合即得固體菌劑，混合菌劑的有效活菌數達108-1011個/g。本發(fā)明的混合菌劑能高效去除污染場地土壤和水中的多環(huán)芳烴，且在場地中具有活性高，生長繁殖快，適應性強，對環(huán)境不造成二次污染等優(yōu)點。文檔編號C12N11/00GKCN101735996SQ200910242388公開日2010年6月16日申請日期2009年12月10日發(fā)明者廖曉勇,閻秀蘭,馬棟申請人:中國科學院地理科學與資源研究所導出引文BiBTeX,EndNote,RefMan