專利名稱:用于以高品質(zhì)和高數(shù)量制造重組蛋白的人類宿主細胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于以高品質(zhì)和高數(shù)量制造重組蛋白的人類宿主細胞，且更具體來說，涉及通過使用基因工程技術(shù)使人類胚腎來源的細胞與人類B細胞來源的細胞融合產(chǎn)生的人類宿主細胞，其中所述人類宿主細胞具有所需穩(wěn)定特征以有效地用于制造異源重組蛋白。
背景技術(shù)：
迄今為止，大部分用于人類用途的基于重組蛋白的藥物是使用非人類哺乳動物細胞制造的，例如中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CH0)細胞、小鼠黑色素瘤(mousemelanoma,NS0)細胞·和小鼠雜交瘤(SP2/0)細胞。已試圖使用人類細胞系來制造治療性重組蛋白，例如使用人類胚腎293細胞來制造活化蛋白C(西格斯(Xigris))(禮來公司(EliLylly), 2001)、使用納馬瓦(Namalwa)細胞來制造干擾素_β (威康研究實驗室(WellcomeResearch Laboratory)，1999)、利用HKBll細胞來制造截短重組因子VIII和多種抗體(曹(Cho)等人，2003，生物技術(shù)進展(Biotech.Prog) 19:229-232)和利用PER.C6細胞來制造多種抗體和病毒DNA (法勞(Fallaux)等人，1998，人類基因療法(Human Gene Therapy)，9:1909-1917)(約翰(Jones)等人，2003，生物技術(shù)進展(Biotechnol.Prog.) 19:163-168 和謝(Xie)等人，2003，生物技術(shù)與生物工程(Biotech.Bioeng.) 83:45-52)。
美國專利第6，136，599號和韓國專利第627，753號揭示使用人類宿主細胞HKB11細胞來制造難以在CHO細胞中表達的蛋白質(zhì)(曹(Cho)等人，2003，生物技術(shù)進展(Biotech.Prog) 19:229-232)(曹(Cho)和陳(Chan)，2002，生物醫(yī)學(xué)科學(xué)(BiomedicalScience) 9:631-638)。美國專利第6，358，703B1號和韓國專利第616，028號揭示一種利用HKB 11細胞來制造截短重組因子VIII的方法。HKB細胞是一種來源于HH514-16的細胞系且包含在B細胞固定和病毒產(chǎn)生方面有缺陷的埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus,EBV)的基因組(拉布森(Rabson)等人，1983，美國科學(xué)院院報(PNAS USA) 87:3660-3664)。HKB細胞顯示諸如高密度生長、高轉(zhuǎn)染效率和簡單MTX誘導(dǎo)性擴增、目標蛋白的大量分泌和IgM表達消除等特征，這些特征適于制造治療性蛋白質(zhì)。然而，觀察到，在細胞培養(yǎng)期間EBV趨向于從HKB細胞中丟失(張(Chang)等人，2002，病毒學(xué)雜志(J Virol.) 76:3168-3178)。這種趨勢表明HKB可能變得不含EBV，從而無法保持各種用于有效表達異源基因的有益性質(zhì)。
因為EBV基因組并不以游離基因體形式存在，但可插入納馬瓦細胞的染色體中(松尾(Matsuo)等人，科學(xué)(Science) 1984 年 12 月 14 日:1322-1325，亨德森(Henderson)等人，1983，美國科學(xué)院院報(PNAS USA) 80:1987-1991和羅斯(Rose)等人，2002，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol.) 40:2533-25440)，所以本發(fā)明者已開發(fā)一種新穎人類宿主細胞系，其使用納馬瓦細胞保留EBV來源的特征而無病毒產(chǎn)生。

發(fā)明內(nèi)容
[0005]技術(shù)問題
本發(fā)明的一個目標是提供一種通過使人類胚腎來源的細胞與人類B細胞來源的細胞融合產(chǎn)生的新穎人類宿主細胞系，其中埃-巴二氏病毒(EBV)基因組插入其染色體中。
本發(fā)明的另一個目標是提供一種人類宿主細胞用于制造重組蛋白的用途。
技術(shù)解決方案
根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種通過使人類胚腎來源的細胞與人類B細胞來源的細胞融合產(chǎn)生的人類宿主細胞，其中埃-巴二氏病毒(EBV)基因組插入其染色體中。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種人類宿主細胞用于制造重組蛋白(包含單克隆抗體)的用途。
現(xiàn)將參考附圖更充分地描述本發(fā)明，在附圖中顯示本發(fā)明的例示性實施例。
根據(jù)本發(fā)明的一實施例的人類宿主細胞是通過使人類胚腎來源的細胞與人類B細胞來源的細胞融合產(chǎn)生的，其中埃-巴二氏病毒(EBV)基因組插入其染色體中。
所述人類胚腎來源的細胞可包含人類胚腎細胞、來源于人類胚腎細胞的細胞、來源于另一種人類胚腎來源的細胞的細胞和由任何上文所提及的細胞進行有絲分裂得到的細胞。本文中所使用的‘來源于’意欲包含(但不限于)正常的細胞有絲分裂和諸如轉(zhuǎn)染、細胞融合或用于改變細胞或制造具有新穎特征的細胞的其它基因工程或細胞生物學(xué)技術(shù)等過程。具體來說，人類胚腎來源的細胞可為293來源的細胞，且優(yōu)選為293細胞。所述293細胞展現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率和高蛋白質(zhì)生產(chǎn)率水平，但在無血清懸浮培養(yǎng)物中出現(xiàn)聚集。
染色體中有EBV基因組插入的人類B細胞來源的細胞可包含人類B細胞、來源于人類B細胞的細胞、來源于另一種人類B細胞的細胞或由細胞有絲分裂得到的細胞。本文中所使用的‘來源于’意欲包含(但不限于)正常的細胞有絲分裂、轉(zhuǎn)染、細胞融合或用于改變細胞或制造具有新穎特征的細胞的其它基因工程或細胞生物學(xué)技術(shù)。具體來說，染色體中具有EBV基因組的人類B細胞來源的細胞可為納馬瓦細胞。所述納馬瓦細胞具有低轉(zhuǎn)染效率，但在懸浮培養(yǎng)物中生長良好，而且無聚集。
技術(shù)解決方案
EBV基因組一般以游離基因體形式存在于B細胞中，但可插入諸如納馬瓦細胞等一些B細胞的染色體中。使用這些優(yōu)越和獨特的特征，本發(fā)明的一實施例提供一種穩(wěn)定人類宿主細胞，其盡管具有病毒信息，但不會產(chǎn)生病毒，可進行制備。因為EBV基因組基因中oriP表達載體所需的埃-巴二氏核抗原I (Epstein-Barr nuclear antigen I, EBNAI)基因和抗細胞凋亡所需的BHRFl和BALFl基因(卡布拉斯(Cabras)等人，2005，臨床病毒學(xué)雜志(J ClinicalVirology) 34:26-34)在納馬瓦細胞中表達，所以這些基因有效地用作宿主細胞中的病毒信息。另外，因為僅在游離型基因組中表達的作為裂解周期(lytic cycle)基因誘導(dǎo)初始蛋白質(zhì)表達的BZLFl基因(康垂曼(Countryman)等人，1987，病毒學(xué)雜志(J Virol),61 =3672-3679)和 LMP2 基因(盛普(Sample)等人，病毒學(xué)雜志(J Virol)63:933-937)并不在納馬瓦細胞中表達，所以可制備不產(chǎn)生病毒的安全宿主細胞(M.伯納斯柯尼(M.Bernasconi)等人.病毒學(xué)雜志(Virology Journal), 2006, 3:43-57)。
本發(fā)明實施例的人類宿主細胞是通過使人類胚腎來源的細胞與人類B細胞來源的細胞融合產(chǎn)生，其中埃-巴二氏病毒(EBV)基因組插入其染色體中。因此，所述人類宿主細胞是具有人類胚腎來源的細胞(例如293細胞)與人類B細胞來源的細胞(例如納馬瓦細胞)兩者的有益性質(zhì)的新穎細胞系。通過選擇293細胞作為人類宿主細胞的一種融合搭配物，可改良人類宿主細胞的轉(zhuǎn)染效率和蛋白質(zhì)生產(chǎn)率。另外，通過選擇納馬瓦細胞作為融合搭配物，(i)容易維持培養(yǎng)物的懸浮狀態(tài)；(ii)宿主細胞是安全的，不會產(chǎn)生病毒粒子；
(iii)因為EBNAl蛋白在宿主細胞中連續(xù)表達，所以oriP表達載體中不需要包含EBNAl基因；(iv)細胞凋亡可通過諸如BHRFl和BALFl等病毒bcl_2同源基因來抑制。
此外，人類B細胞來源的細胞(例如納馬瓦細胞)可為具有HAT敏感性和G418抗性的細胞。為了制備本發(fā)明實施例的具有人類胚腎來源的細胞與人類B細胞來源的細胞兩者的有用性質(zhì)的人類宿主細胞，需要在細胞融合后對具有兩種細胞的有用性質(zhì)的克隆進行基因型選擇的過程。因為人類胚腎來源的細胞(即293細胞)具有HAT抗性和G418敏感性，所以選擇具有HAT敏感性和G418抗性的人類B細胞來源的細胞(例如納馬瓦細胞)作為人類胚腎來源的細胞的融合搭配物。
根據(jù)本發(fā)明的一實施例，使用293細胞和納馬瓦細胞來開發(fā)通過使人類胚腎來源的細胞與人類B細胞來源的細胞融合產(chǎn)生的新穎人類宿主細胞。首先，在補充有胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和6-硫鳥嘌呤的培養(yǎng)基中培養(yǎng)納馬瓦細胞系以獲得具有HAT敏感性的納馬瓦細胞作為與293細胞融合的搭配物。測量納馬瓦細胞對含HAT培養(yǎng)基的敏感性，同時增加6-硫鳥嘌呤的濃度，歷時數(shù)個月的選擇期。用pSV2neo質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HAT敏感性納馬瓦細胞群體，且選擇對G418具有抗性的細胞群體用作293細胞的融合搭配物。接著，根據(jù) RH.肯尼特(Kennett RH.)細胞融合(Cell fusion).酶學(xué)方法(Methods Enzymol) 58:345-359 ；1979中所揭示的使用聚乙二醇(PEG)的方法進行293細胞與HAT敏感性納馬瓦細胞的融合。然而，細胞融合并不限于所述方法且可根據(jù)所屬領(lǐng)域中常用的方法來進行。
根據(jù)本發(fā)明的一實施例的通過使293細胞與納馬瓦細胞融合產(chǎn)生的人類宿主細胞被稱為F2N(293與納馬瓦的融合細胞)。預(yù)期因為EBV基因組以整合到F2N染色體中的形式存在，所以在長期培養(yǎng)期間EBV基因組不會從F2N細胞中丟失，這與在其它特征方面與F2N細胞類似的HKB細胞不同。為了證明這種情況，選擇數(shù)個F2N克隆且培養(yǎng)于無血清懸浮培養(yǎng)基中超過I年。結(jié)果，在培養(yǎng)于無血清懸浮培養(yǎng)基中超過I年的所有細胞群體中都觀察到EBNAl的表達(參見圖5和6)，這說明即使長時間培養(yǎng)F2N細胞，EBV基因組也不會從F2N細胞中丟失。
為了在F2N克隆中選擇具有高轉(zhuǎn)染效率的克隆，用表達IgG的pCT132載體(參見圖3)轉(zhuǎn)染F2N克隆的細胞,且使用酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbentassay, ELISA)對轉(zhuǎn)染子進行分析以評估抗體產(chǎn)生效率(參見圖4A到4C)。一般來說，F(xiàn)2N細胞的轉(zhuǎn)染效率高于293細胞。此外，選擇克隆之一，具有高轉(zhuǎn)染效率且在無血清懸浮培養(yǎng)基中生長良好的F2N78，接著在2008年4月11日保藏于韓國典型菌種保藏中心(KoreanCollection for Type Cultures,KCTC))(生物資源中心(Biological Resource Center),韓國生物科學(xué)與生物技術(shù)研究所(Korean Research Institute of Bioscience andBiotechnology),大田市儒城區(qū) 111 Kwahack-ro (lllKwahack-ro, Yuseong-gu, Daejeon))(保藏編號:KCTC11309BP)。
為了鑒別通過使293細胞與納馬瓦細胞融合產(chǎn)生的F2N細胞是否具有所需有益性質(zhì)，使用從F2N78細胞中提取的mRNA進行反轉(zhuǎn) 錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerase chain reaction, RT-PCR)以鑒別 EBNAl、Ig-μ、Ig-κ 和 N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III(GnTIII)的表達。結(jié)果顯示F2N78克隆表達EBNAl和GnTIII，但不表達IgM(參見圖6)。為了鑒別EBNAl、IgM和α (2,6)唾液酸轉(zhuǎn)移酶(α (2，6) ST)的表達，進行免疫熒光法(IF)。結(jié)果顯示F2N78表達EBNAl和α (2，6) ST，但不表達IgM (參見圖5)。在這點上，EBNAl的表達表明F2N克隆中存在EBV基因組，且GnTIII和α (2，6) ST的表達表明糖基化分布類似于人類。IgM的不表達表明在納馬瓦細胞中觀察到的免疫球蛋白的表達在由細胞融合獲得的F2N細胞中受到抑制。由F2N克隆(尤其由F2N78細胞)制造治療性重組單克隆抗體需要這些特征。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一實施例的人類宿主細胞組成性表達EBNAl蛋白，表達產(chǎn)生類似于人類的糖基化分布所涉及的酶，并且不表達IgM蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的一實施例的人類宿主細胞提供EBNAl的穩(wěn)定表達。EBNAl是大小為約3kb的基因并且是oriP表達載體在細胞中自主復(fù)制的必要元件。如果EBNAl以順式或反式形式與oriP表達載體一起存在于細胞中，那么oriP表達載體可在人類細胞中正常復(fù)制。然而，如果EBNAl不與oriP表達載體分開存在(呈反式形式)，而是存在于oriP表達載體中(呈順式形式)，那么可能會因為表達載體太大而使載體DNA不易進行操作，并且包含EBNAl基因在內(nèi)的所有基因都可能無法有效地轉(zhuǎn)移到細胞中并進行表達。然而，因為EBNAl蛋白由整合到F2N78細胞染色體中的EBV基因組組成性表達，所以oriP質(zhì)粒在載體構(gòu)建時不需要具有EBNAl基因。因此，oriP表達載體可被有效地操作，并且載體中所含的基因可容易地進行表達。
根據(jù)本發(fā)明的一實施例的人類宿主細胞也組成性表達與類似于人類的糖基化分布相關(guān)的酶。因為由根據(jù)本發(fā)明的一實施例的人類宿主細胞制造的蛋白質(zhì)具有類似于人類的糖基化分布，所以相較于由諸如CHO細胞等非人類細胞制造的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)可具有較低活體內(nèi)免疫原性和較長活體內(nèi)半衰期，從而改良基于蛋白質(zhì)的藥物的功效。
另外，本發(fā)明的一實施例的人類宿主細胞不表達在納馬瓦細胞中表達的IgM蛋白。因此，根據(jù)本發(fā)明的 一實施例的人類宿主細胞具有用于制造治療性重組單克隆抗體的必要特征。
為了鑒別F2N78細胞的抗細胞凋亡活性，用不同濃度的丁酸鈉處理F2N78細胞。一般來說，在細胞培養(yǎng)期間，丁酸鈉使受CMV或SV40啟動子調(diào)節(jié)的基因的表達增加(李(Lee)等人，1993，細胞(Cell) 72:73_84，考科特(Cockett)等人，1990，生物技術(shù)(Bio/technology) 8:662-667,張(Chang)等人，1999,自由基研究(Free Rad Res) 30:85-91,和高爾曼(Gorman)等人，1983,核酸研究(Nucl Acid Res) 11:7631-7648)。丁酸鈉還阻滯細胞周期或誘導(dǎo)細胞分化，從而導(dǎo)致細胞凋亡(庫斯特(Cuisset)等人，1998，生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊(Biochem Biophy Res Commun) 246:760_764，庫斯特(Cuisset)等人，1998,生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊(Biochem Biophy Res Commun) 246:760764)。然而，根據(jù)本發(fā)明的一實施例的F2N78細胞顯示即使在丁酸鈉處理下細胞凋亡也會減少，并且在一些情況下，生長速率比對照組(用OmM 丁酸鈉處理的F2N78)高。作為對照組的納馬瓦細胞顯示在丁酸鈉處理后細胞存活力降低并且在所有條件下細胞生長都受到抑制，而293細胞在暴露于高濃度的丁酸鈉時顯示細胞凋亡(參見圖9A到9D)。
為了鑒別F2N78細胞的抗細胞凋亡細胞生長，使用RT-PCR證實EBV基因組中所含的病毒bcl-2同源基因BHRFl和BALFl的表達。如圖10中所示，BHRFl在未經(jīng)處理與用丁酸鈉處理的納馬瓦細胞中都表達。另一方面，BHRFl不在未經(jīng)處理或用丁酸鈉處理的F2N78細胞中表達。然而，在不考慮用丁酸鈉處理的情況下，BALFl在納馬瓦細胞與F2N78細胞中都表達。BHRFl與BALFl兩者都不在作為對照組的293細胞中表達。據(jù)報導(dǎo)，當BALFl與BHRFl兩者同時表達時，BALFl抑制BHRFl的抗細胞凋亡活性(貝婁(Bellows)等人，2002，病毒學(xué)雜志(J Virol.) 76:2469_2479，馬歇爾(Marshall)等人，1999，病毒學(xué)雜志(JVirol.) 73 =5181-5185) 這一特征可見于納馬瓦細胞中。因此，顯示僅BALFl在F2N78細胞中表達的上述結(jié)果可證明F2N78細胞具有抗細胞凋亡活性，應(yīng)闡明其潛在機制。所述抗細胞凋亡細胞生長模式也在其它F2N克隆中觀察到。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一實施例的人類宿主細胞當在丁酸鈉存在下培養(yǎng)時顯示抗細胞凋亡活性。本發(fā)明指示根據(jù)本發(fā)明的一實施例的人類宿主細胞即使當培養(yǎng)基中不添加丁酸鈉時，也可在長期分批培養(yǎng)期間對天然存在的細胞凋亡具有抗性。
比較由CHO和F2N78產(chǎn)生的兩種產(chǎn)生抗體的細胞系以鑒別當用丁酸鈉處理時細胞的抗體生產(chǎn)率。與未用丁酸鈉處理的對照組相比，用丁酸鈉處理的CHO來源的克隆的細胞生長速率降低50%，且CHO來源的克隆的生產(chǎn)率加倍(參見圖11)。另一方面，與未用丁酸鈉處理的對照組相比，用丁酸鈉處理的F2N78來源的克隆的細胞生長速率增加達2倍，且F2N78來源的克隆的生產(chǎn)率增加4到5倍(參見圖12)。上述結(jié)果表明用丁酸鈉處理的F2N78細胞的抗細胞凋亡影響抗體生產(chǎn)率的增加。
為了在F2N78細胞中使用oriP表達載體鑒別抗體生產(chǎn)率，用兩種不同的oriP表達載體pCT132和pCT125轉(zhuǎn)染F2N78細胞，并隨后比較抗體生產(chǎn)率。當pCT125在質(zhì)粒中包含EBNAl編碼序列時，pCT132在質(zhì)粒中不包含EBNAl編碼序列。如圖7中所示，與用pCT125轉(zhuǎn)染的細胞相比，用PCT132轉(zhuǎn)柒的細胞展現(xiàn)類似或較高的抗體生產(chǎn)率。一般來說，宜使用瞬時轉(zhuǎn)染來制造少量新藥開發(fā)過程中所需的蛋白質(zhì)。因為根據(jù)本發(fā)明的一實施例的人類宿主細胞組成性表達EBNA1，所以細胞可適用于基于使用無EBNAl基因的表達載體(諸如PCT132表達載體)進行瞬時轉(zhuǎn)染的新藥開發(fā)。
根據(jù)本發(fā)明的一實 施例的人類宿主細胞可用于制造重組蛋白?？蓪θ祟愃拗骷毎M行基因工程改造以表達多種重組蛋白。所述重組蛋白可包含人類治療性重組蛋白，例如治療性單克隆抗體和除單克隆抗體以外的治療性重組蛋白。
有利效果
本發(fā)明提供一種通過對人類胚腎來源的細胞與人類B細胞來源的細胞進行體細胞融合產(chǎn)生的人類宿主細胞，其中埃-巴二氏病毒(EBV)基因組整合到其染色體中。使用本發(fā)明的一實施例的人類宿主細胞，可在短時間內(nèi)制造用于研究的蛋白質(zhì)，并且可以高數(shù)量和高品質(zhì)制造用于人類用途的基于異源重組蛋白的藥物。


本發(fā)明的上述和其它特征和優(yōu)點將通過參考附圖來詳細描述其例示性實施例而變得顯而易見。
圖1說明融合F2N細胞和選擇F2N78克隆的過程。
圖2A到2D說明在初始階段F2N克隆的各種生長模式，其中在選擇過程中移除如圖2C和2D中所示的以聚集體形式生長的克隆。[0038]圖3說明本文中所使用的表達載體的物理圖。
圖4A到4C說明為選擇具有高IgG表達的F2N克隆所進行的瞬時轉(zhuǎn)染的結(jié)果，其中圖4A說明第一次篩選的結(jié)果，圖4B說明從圖4A中選擇的17個克隆的第二次篩選的結(jié)果，并且圖4C說明在最后所選的F2N78細胞與293細胞之間比較IgG生產(chǎn)率的結(jié)果。由三次重復(fù)實驗獲得圖4C中所示的結(jié)果。
圖5A說明Ig- μ和Ig- K的表達，且圖5Β說明使用免疫熒光檢驗檢測到的EBNAl和α (2，6)-ST的表達。
圖6說明使用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測的Gntlll、Ig-μ和EBNAl在F2N78、納馬瓦和293細胞中的表達，其中使用CHO細胞作為陰性對照組。表I中顯示對GntII1.1g-μ和EBNAl蛋白具特異性的引物。
圖7是說明在F2N78細胞和293細胞中oriP表達載體(pCT125和pCT132)的抗體生產(chǎn)率的圖。
圖8是說明通過用pCT132對F2N78細胞進行瞬時轉(zhuǎn)染所得的抗體生產(chǎn)率的圖，所述PCT132是無EBNAl基因的表 達載體。由4次重復(fù)實驗獲得此處所示的結(jié)果。
圖9A到9D是說明丁酸鈉對CHO細胞(圖9A)、納馬瓦細胞(圖9B)、293細胞(圖9C)和F2N78細胞(圖9D)的細胞生長的影響的圖，其中和4mM指示培養(yǎng)物中所用的丁酸鈉濃度，且ImM-存活力、2mM-存活力和4mM_存活力指示用相應(yīng)濃度的丁酸鈉處理的培養(yǎng)物的細胞存活力。
圖10說明使用RT-PCR檢測的BHRFl和BALFl在用丁酸鈉處理的F2N78、納馬瓦和293細胞中的表達，其中0、1和4指示分別添加到各培養(yǎng)基中的丁酸鈉的濃度(mM)。表I中寫出RT-PCR中所用的引物組。
圖11是說明丁酸鈉對CH0#247細胞的抗體生產(chǎn)率的影響的圖。
圖12是說明丁酸鈉對F2N78_Ig細胞的抗體生產(chǎn)率的影響的圖。
具體實施方式
下文將參考以下實例更詳細地描述本發(fā)明。以下實施例僅出于說明性目的且不希望限制本發(fā)明的范圍。
材料與方法
1.細胞和質(zhì)粒
人類胚腎(293)細胞(ATCC CRL-1573)和納馬瓦細胞(ATCC CRL-1432)是從美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)獲得。圖3說明本文中所使用的表達載體的分解圖。
2.轉(zhuǎn)染
使用電穿孔和基于陽離子聚合物的方法來進行轉(zhuǎn)染。
電穿孔:將對數(shù)生長的3X IO6個細胞再懸浮于300 μ I含有12 μ g質(zhì)粒pSV2neo載體(2 μ g)和具有基質(zhì)連接區(qū)(matrix attached region, MAR)序列的載體(10 μ g)的RPMI 1640培養(yǎng)基中。使用GenePulse II電穿孔儀(伯樂公司(Bio-Rad)) (220V/960微法拉(microfarad))進行電穿孔。將轉(zhuǎn)染子懸浮于生長培養(yǎng)基中并培養(yǎng)72小時。接著，將細胞培養(yǎng)于補充有l(wèi)mg/mlG418和10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的選擇性培養(yǎng)基中約14天。發(fā)現(xiàn)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞活躍地生長，而對照組細胞在選擇性培養(yǎng)基中不生長。選擇經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞且另外培養(yǎng)于補充有l(wèi)mg/ml G418的選擇性培養(yǎng)基中。通過使用新霉素基因特異性引物進行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來鑒別新霉素基因的存在。
基于陽離子聚合物的方法:根據(jù)制造商的說明書，使用Lipofectamine LTX(英杰公司(Invitrogen), 15338-100)和 FreeStyle Max (英杰公司(Invitrogen), 16447-100)進行轉(zhuǎn)染。當使用Lipofectamine LTX試劑時,在轉(zhuǎn)染前一天,將細胞接種于6孔板中以使得在轉(zhuǎn)染當天細胞的匯合度達到每孔50%到80%。在各孔中使用2.5yg DNA和6.25 μ ILTX進行轉(zhuǎn)染。當使用FreeStyle Max試劑時，在懸浮培養(yǎng)物中進行轉(zhuǎn)染。對于懸浮培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)染，接種生長于無血清培養(yǎng)基(FreeStyle 293表達培養(yǎng)基,英杰公司(Invitrogen),12338，下文稱為FreeStyle 293培養(yǎng)基)或EX-CELL 293無血清培養(yǎng)基(西格馬公司(Sigma)，14571C，下文稱為EX-CELL 293培養(yǎng)基)中的細胞以使得在轉(zhuǎn)染當天細胞濃度被調(diào)整到每I毫升含I X IO6個細胞。在OptiPRO SFM II (英杰公司(Invitrogen)，12309)培養(yǎng)基中進行轉(zhuǎn)染，而DNA和FreeStyle Max試劑的添加比率是1:1。
3.免疫熒光法(TF)
為了檢測EBNAl 的表達，應(yīng)用抗補體免疫突光法(ant1-complementimmunofIluroescence, ACIF)(瑞德曼(Reedman)和基利恩(Klein), 1973,以及福萊森(Fresen)和楚爾 豪森(zur Hausen), 1976)。首先,將細胞涂抹在載玻片上且在_20°C下使用甲醇固定5分鐘。作為第一反應(yīng)抗體，使用具有高抗EBNA效價的人類血清與所述細胞反應(yīng)。接著，用人類補體(血清蛋白)處理細胞以擴增信號形式EBNAl，并且使用接合熒光物質(zhì)的抗人類補體C3抗體(接合FITC的抗人類補體C3抗體，美國生物公司(USBiological)，C7850-14C)檢測EBNAl染色。用1:1比率的甘油溶液與磷酸鹽緩沖液處理所得載片。
為了檢測Ig-μ和Ig-κ的表達，以與上述相同的方式，用接合熒光物質(zhì)的抗人類IgM抗體(接合FITC的經(jīng)親和力純化的山羊抗人類IgM，具有μ鏈特異性，西格馬公司(Sigma),F5384)和接合熒光物質(zhì)的抗人類κ鏈(山羊體內(nèi)產(chǎn)生的經(jīng)親和力純化的熒光素抗人類K鏈，威克特公司(Vector)，F(xiàn)1-3060)處理細胞。
為了檢測a (2，6)ST蛋白的表達，以與上述相同的方式，用接合熒光物質(zhì)的西洋接骨木(Sambucus nigra)凝集素(接合FITC的西洋接骨木(接骨木樹皮)_SNA_1，EY實驗室(EY laboratories), F-2602)處理細胞。
4.EBNAUGnTII1、Ig-μ、BALFl、BHRFl 的 RT-PCR
使用RNeasy .Plus Mini試劑盒(恰根公司(Qiagen), 74134)從細胞中提取mRNA，并且使用OneSt印RT-PCR試劑盒(恰根公司(Qiagen)，210212)進行RT-PCR。各引物序列顯示于下表I中。使用GeneAmp PCR系統(tǒng)9700 (應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystems))進行RT-PCR，且用于RT-PCR的階段和條件如下:⑴反轉(zhuǎn)錄(I個循環(huán)，50°C下30分鐘)；(ii)反轉(zhuǎn)錄酶失活和cDNA變性(I個循環(huán)，95°C下15分鐘)；(iii) PCR擴增(35個循環(huán)，94°C下30秒，52°C下I分鐘和72°C下30秒；和(iv)延伸(I個循環(huán)，72°C下10分鐘)。使用瓊脂糖凝膠電泳鑒別RT-PCR的產(chǎn)物。
表I.RT-PCR中所用的引物序列
權(quán)利要求
1.一種人類宿主細胞，其特征在于所述細胞i)組成性表達EBNAl蛋白；ii)不表達IgM蛋白；iii)持續(xù)產(chǎn)生類似于人類的糖基化分布；以及iv)表達BALFl，但不表達BHRFl，其選自通過使293細胞與納馬瓦細胞融合產(chǎn)生的人類宿主細胞，其中所述人類宿主細胞是F2N78,以及 F2N78 的 KCTC 保藏編號是 KCTCl 1309BP。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的人類宿主細胞，其用于制造重組蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2 所述的人類宿主細胞，其中所述重組蛋白是單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的人類宿主細胞，其中所述重組蛋白是除單克隆抗體以外的治療性蛋白質(zhì)。
專利摘要
本發(fā)明涉及一種通過使用基因工程技術(shù)使人類胚腎來源的細胞與人類B細胞來源的細胞融合產(chǎn)生的人類宿主細胞。具有良好保持的穩(wěn)定特征的人類宿主細胞可有效地用于制造基于所需異源重組蛋白的藥物。
文檔編號GKCN102057038SQ200980121474
公開日2013年6月19日 申請日期2009年4月10日
發(fā)明者李炫周, 金鍾默, 張珉碩 申請人:株式會社斯特利恩導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (1),