專利名稱:重組crm197的高水平表達(dá)的制作方法
重組CRM197的高水平表達(dá)
相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
本申請(qǐng)要求2010年3月30日提交的題目為“重組CRM197的高水平表達(dá)”的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/319，152的優(yōu)先權(quán)。
發(fā)明背景
白喉毒素(DT)是由白喉?xiàng)U菌(Corynebacterium diphtheriae)的產(chǎn)毒菌株合成和分泌的蛋白質(zhì)性毒素。產(chǎn)毒菌株含有攜帯毒素基因的噬菌體溶素原。DT被合成為535個(gè)氨基酸的多肽，其經(jīng)歷蛋白水解以形成成熟的毒素。成熟的毒素包含由ニ硫鍵連接的兩個(gè)亞基A和B。由完整DT的C末端部分形成的B亞基使DT能夠結(jié)合細(xì)胞膜并通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到胞質(zhì)中。一旦進(jìn)入細(xì)胞，由完整DT的N末端部分形成的酶的A亞基催化延伸因子
2(EF-2)的ADP核糖基化。其結(jié)果是，EF-2被滅活、蛋白質(zhì)合成停止和細(xì)胞死亡。白喉毒素 是高度細(xì)胞毒性的，單個(gè)分子可以致死細(xì)胞，且10ng/kg的劑量可以殺死動(dòng)物和人。
CRM197蛋白是DT的無(wú)毒的、免疫學(xué)交叉反應(yīng)的形式。已研究了其作為DT增強(qiáng)劑或疫苗抗原的潛在用途。CRM197是通過(guò)由產(chǎn)毒的P棒狀桿菌噬菌體的亞硝基胍誘變構(gòu)建的非產(chǎn)毒噬菌體P 197tQX_感染的白喉?xiàng)U菌產(chǎn)生的。CRM197蛋白具有與DT相同的分子量，但在A亞基中有單堿基變化(鳥(niǎo)嘌呤變?yōu)橄汆堰?的差異。這ー單堿基變化導(dǎo)致氨基酸置換(谷氨酸置換為甘氨酸)，并消除了 DT的毒性性質(zhì)。
使用CRM197作為載體蛋白的結(jié)合多糖疫苗已批準(zhǔn)人體使用。疫苗包括MenVe0 (Novartis Vaccines and Diagnostics)(標(biāo)明用于預(yù)防由腦膜炎球菌亞群A、C、Y和W-135引起的侵襲性腦膜炎球菌疾病的疫苗)、Menjugate (Novartis Vaccines)(腦膜炎雙球菌C群結(jié)合疫苗)、和Prevnar (Wyeth Pharmaceuticals, Inc.)(革巴向于肺炎鏈球菌的七種血清型的兒童肺炎疫苗)和HibTITER (Wyeth)(流感嗜血桿菌b型疫苗)。此外，CRM197具有用作白喉的增強(qiáng)抗原的潛力并正在研究作為用于其它疫苗中的載體蛋白。
用于批準(zhǔn)的治療和研究用途的CRM197高水平表達(dá)的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。CRM197已在例如白喉?xiàng)U菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌中以數(shù)十mg/L的水平表達(dá)。單劑Prevnar結(jié)合疫苗含有大約20ii g CRM197。因此，用于經(jīng)濟(jì)地以約lg/L或以上的水平生產(chǎn)CRM197的方法將極大地促進(jìn)疫苗研究和生產(chǎn)。
發(fā)明概述
本發(fā)明涉及用于在假單胞菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生重組CRM197蛋白的方法，所述方法包括將編碼與指導(dǎo)CRM197蛋白轉(zhuǎn)移到周質(zhì)的分泌信號(hào)融合的CRM197蛋白的核苷酸序列接合到表達(dá)載體中；用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化假單胞菌宿主細(xì)胞；并在適合重組CRM197蛋白表達(dá)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的假單胞菌的宿主細(xì)胞；其中所得的可溶性CRM197的產(chǎn)率是每升約I至約12克。
在實(shí)施方式中，假單胞菌宿主細(xì)胞是至少ー種蛋白酶表達(dá)缺陷的，或假單胞菌宿主細(xì)胞過(guò)表達(dá)至少ー種折疊調(diào)節(jié)因子。在某些實(shí)施方式中，假單胞菌宿主細(xì)胞是hslUV-、prcl-、degPl-、degP2-和aprA-。在實(shí)施方式中，假單胞菌宿主細(xì)胞是hslUV-、prcl-、degPl-、degP2-和 aprA_,并且分泌前導(dǎo)序列是 Azu、IbpS31A、CupA2 或 PbpA20V。在其它實(shí)施方式中，假單胞菌宿主細(xì)胞是hslUV-、prcl-、degPl-、degP2-和aprA-，并且分泌前導(dǎo)肽序列是Azu、IbpS31A、CupA2、PbpA20V或Pbp。在其它實(shí)施方式中，假單胞菌宿主細(xì)胞是Serralysin、HslU、HslV、Prcl、DegPl、DegP2或AprA表達(dá)缺陷的,或假單胞菌宿主細(xì)胞過(guò)表達(dá) DsbA、DsbB、DsbC 和 DsbD。
在具體實(shí)施方式
中，宿主細(xì)胞過(guò)表達(dá)DsbA、DsbB、DsbC和DsbD，且分泌前導(dǎo)序列是Azu。在其它具體實(shí)施方式
中，宿主細(xì)胞是Serralysin表達(dá)缺陷的，并且分泌前導(dǎo)序列是Pbp或Azu。在某些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是HslU和HslV表達(dá)缺陷的，且分泌前導(dǎo)序列是Pbp或Azu。在再其它實(shí)施方式中，假單胞菌宿主細(xì)胞是野生型的，且分泌前導(dǎo)序列是Pbp或 Azu0
在實(shí)施方式中，分泌前導(dǎo)序列是Azu、Pbp、IbpS31A、CupA2或PbpA20V。在其它實(shí)施方式中，分泌前導(dǎo)序列是Azu、IbpS31A、CupA2或PbpA20V。
在實(shí)施方式中，CRM 197核苷酸序列已對(duì)于在假單胞菌宿主細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化。
在實(shí)施方式中，獲得的可溶性CRM197的產(chǎn)率為約0. 5g/L、約0. 6g/L、約0. 7g/L、約0. 8g/L、約 0. 9g/L、約 lg/L、約 I. 5g/L、約 2g/L、約 2. 5g/L、約 3g/L、約 3. 5g/L、約 4g/L、約4. 5g/L、約 5g/L、約 5. 5g/L、約 6g/L、約 6. 5g/L、約 7g/L、約 7. 5g/L、約 8g/L、約 8. 5g/L、約9g/L、約 9. 5g/L、約 10g/L、約 10. 5g/L、約 I lg/L、約 12g/L、約 0. 5g/L 至約 lg/L、約 0. 5g/L至約 2g/L、約 0. 5g/L 至約 3g/L、約 0. 5g/L 至約 4g/L、約 0. 5g/L 至約 5g/L、約 0. 5g/L 至約6g/L、約 0. 5g/L 至約 7g/L、約 0. 5g/L 至約 8g/L、約 0. 5g/L 至約 9g/L、約 0. 5g/L 至約 IOg/L、約 0. 5g/L 至約 I lg/L、約 0. 5g/L 至約 12g/L、約 lg/L 至約 2g/L、約 lg/L 至約 3g/L、約lg/L 至約 4g/L、約 lg/L 至約 5g/L、約 lg/L 至約 6g/L、約 lg/L 至約 7g/L、約 lg/L 至約 8g/L、約 lg/L 至約 9g/L、約 lg/L 至約 10g/L、約 lg/L 至約 llg/L、約 lg/L 至約 12g/L、約 2g/L至約3g/L、約2g/L至約4g/L、約2g/L至約5g/L、約2g/L至約6g/L、約2g/L至約7g/L、約2g/L至約8g/L、約2g/L至約9g/L、約2g/L至約10g/L、約2g/L至約I lg/L、約2g/L至約12g/L、約 3g/L 至約 4g/L、約 3g/L 至約 5g/L、約 3g/L 至約 6g/L、約 3g/L 至約 7g/L、約 3g/L 至約 8g/L、約 3g/L 至約 9g/L、約 3g/L 至約 10g/L、約 3g/L 至約 I lg/L、約 3g/L 至約 12g/L、約4g/L至約5g/L、約4g/L至約6g/L、約4g/L至約7g/L、約4g/L至約8g/L、約4g/L至約 9g/L、約 4g/L 至約 10g/L、約 4g/L 至約 I lg/L、約 4g/L 至約 12g/L、約 5g/L 至約 6g/L、約5g/L至約7g/L、約5g/L至約8g/L、約5g/L至約9g/L、約5g/L至約10g/L、約5g/L至約llg/L、約 5g/L 至約 12g/L、約 6g/L 至約 7g/L、約 6g/L 至約 8g/L、約 6g/L 至約 9g/L、約 6g/L 至約 10g/L、約 6g/L 至約 llg/L、約 6g/L 至約 12g/L、約 7g/L 至約 8g/L、約 7g/L 至約 9g/L、約 7g/L 至約 10g/L、約 7g/L 至約 llg/L、約 7g/L 至約 12g/L、約 8g/L 至約 9g/L、約 8g/L至約10g/L、約8g/L至約11^/し、約88/し至約12g/L、約9g/L至約10g/L、約9g/L至約Hg/L、約 9g/L 至約 12g/L、約 10g/L 至約 llg/L、約 10g/L 至約 12g/L 或約 llg/L 至約 12g/L。
本發(fā)明涉及用于在假單胞菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生重組CRM197蛋白的方法，所述方法包括將編碼與指導(dǎo)CRM197蛋白轉(zhuǎn)移到周質(zhì)的分泌信號(hào)融合的CRM197蛋白的核苷酸序列接合到表達(dá)載體中，用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化假單胞菌宿主細(xì)胞，并在適合重組CRM197蛋白表達(dá)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的假單胞菌宿主細(xì)胞；其中所得的可溶性CRM197的產(chǎn)率是每升約I至約12克；并且還包括在活性分析中測(cè)定重組CRM197蛋白的活性，其中產(chǎn)生的可溶性CRM197的約40%至約100%是活性的。在相關(guān)的實(shí)施方式中，活性分析是免疫學(xué)分析或受體結(jié)合分析。
在實(shí)施方式中，表達(dá)載體包含可操作地連接到蛋白編碼序列上的Iac衍生啟動(dòng)子(derivative promoter),且其中所述培養(yǎng)包括使用濃度為約0. 02至約I. OmM的IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)子，誘導(dǎo)時(shí)的細(xì)胞密度是約40至約200個(gè)吸光度単位(AU)的光密度，培養(yǎng)物的pH為約6至約7. 5，和生長(zhǎng)溫度為約20至約35°C。
在某些實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)。
通過(guò)引用引入
在本說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)通過(guò)引用引入本文，正如各個(gè)出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)都特別地和単獨(dú)地說(shuō)明通過(guò)引用引入本文一祥。
附圖簡(jiǎn)述
本發(fā)明的新穎特征在所附的權(quán)利要求
書(shū)中詳細(xì)說(shuō)明。參照下面給出的利用了本發(fā)明原理的說(shuō)明性實(shí)施方式的詳細(xì)說(shuō)明和附圖可以更好的理解本發(fā)明的特征和優(yōu)勢(shì)。
圖I.示例性的優(yōu)化CRM197基因的氨基酸和DNA序列。A.氨基酸序列(SEQ IDNO: 1)B. DNA 序列(SEQ ID NO 2)
圖2. CRM197的高通量表達(dá)分析。用毛細(xì)管凝膠電泳(SDS-CGE)分析使用如圖IB所示的DNA序列表達(dá)的CRM 197蛋白。測(cè)試的40個(gè)CRM197表達(dá)菌株的可溶性部分顯示于由SDS-CGE數(shù)據(jù)產(chǎn)生的凝膠樣圖像。如表6中描述的菌株名稱列于各道上方。熒光假單胞菌表達(dá)的CRM197在SDS-CGE上作為約為58kDa的單一條帶遷移(箭頭)。
發(fā)明詳述
CRM197
交叉反應(yīng)物質(zhì)197(CRM197)是由具有錯(cuò)義突變的DT基因產(chǎn)生的白喉毒素變異體。CRM197缺乏ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶(ADPRT)活性，且因此是無(wú)毒的。CRM197的基因具有單堿基置換，導(dǎo)致谷氨酸替代甘氨酸結(jié)合在第52位殘基上(見(jiàn)，例如Bishai等，1987，“High-Level Expression of a Proteolytically sensitive Diphtheria Toxin Fragmentin Escherichia coli，，，J. Bact. 169 (11) :5140-51, Giannini 等，1984, “The Amino-AcidSequence of Two Non-Toxic Mutants of Diphtheria Toxin CRM45 和 CRM197，，，NucleicAcids Research 12(10) :4063-9 和 GenBank Acc. No. 1007216A,全部通過(guò)引用引入本文)。
可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法或通過(guò)在白喉?xiàng)U菌或其它微生物中表達(dá)以低水平制備CRM197蛋白。可以從可由很多公開(kāi)來(lái)源包括美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心得到的產(chǎn)生毒素的菌株中獲得天然存在的或野生型的白喉毒素。用于在白喉?xiàng)U菌中產(chǎn)生CRM197蛋白的質(zhì)粒系統(tǒng)由例如美國(guó)專利 No. 5，614，382,“Plasmid for Production of CRM Protein andDiphtheria Toxin”的描述,其以其整體通過(guò)引用引入。
核苷酸序列可使用重組DNA技術(shù)(由例如Sambrook等，Molecular Cloning, aLaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 19899 描述)制備，且也可以基于由棒狀桿菌噬菌體P攜帯的白喉毒素的野生型結(jié)構(gòu)基因的已知DT核苷酸序列通過(guò)定點(diǎn)誘變技術(shù)制備(參見(jiàn)，例如，Greenfield 等，1993, “Nucleotide Sequence of thestructural Gene for Diphtheria Toxin Carried by Corynebacteriophage 18，，， ProcNat Acad Sci80 :6953_7，其通過(guò)引用引入)。核苷酸序列可如本文其他地方所述進(jìn)行優(yōu)化。[0029]密碼子優(yōu)化
在異源表達(dá)系統(tǒng)中，優(yōu)化步驟可以提高宿主產(chǎn)生外源蛋白的能力。蛋白質(zhì)表達(dá)是由一系列包括那些影響轉(zhuǎn)錄、mRNA加工及翻譯的穩(wěn)定性和起始的因素的許多因素控制的。多核苷酸優(yōu)化步驟可以包括提高宿主產(chǎn)生外源蛋白能力的步驟，以及輔助研究人員有效地設(shè)計(jì)表達(dá)構(gòu)建體的步驟。優(yōu)化策略可以包括,例如,翻譯起始區(qū)的修飾、mRNA結(jié)構(gòu)元件的改變和不同密碼子偏倚性的使用。優(yōu)化核酸序列以提高在細(xì)菌宿主中異源蛋白的表達(dá)的方法在本領(lǐng)域中是已知的，并在文獻(xiàn)中描述。例如，用于假單胞菌宿主菌株中表達(dá)的密碼子優(yōu)化描述在美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2007/0292918，“Codon Optimization Method”中，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。
因此，優(yōu)化可以處理異源基因的多種序列特征中的任意ー種。作為具體的實(shí)例，稀有密碼子引起的翻譯中止可導(dǎo)致異源蛋白表達(dá)的降低。稀有密碼子引起的翻譯中止包括在目標(biāo)多核苷酸中存在很少在宿主生物體中使用的密碼子可能對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯有負(fù)面影響，因?yàn)樗鼈冊(cè)诳捎玫膖RNA池中的缺少。提高宿主生物體中最佳翻譯的方法包括可導(dǎo)致稀有 宿主密碼子從合成的多核苷酸序列中去除的密碼子優(yōu)化。
替代的翻譯起始也可以導(dǎo)致異源蛋白表達(dá)的降低。替代的翻譯起始可包含偶然地包含能夠作為核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)發(fā)揮功能的基序的合成多核苷酸序列。這些位點(diǎn)可引起從基因內(nèi)部位點(diǎn)起始截短蛋白的翻譯。降低產(chǎn)生截短蛋白(其可能難以在純化過(guò)程中去除)的可能性的ー種方法包括從優(yōu)化的多核苷酸序列中消除推定的內(nèi)部RBS序列。
重復(fù)引起的聚合酶滑脫可以導(dǎo)致異源蛋白表達(dá)的下降。重復(fù)引起的聚合酶滑脫涉及表明會(huì)引起可產(chǎn)生移碼突變的DNA聚合酶的滑脫或ロ吃(stuttering)的核苷酸序列重復(fù)。這樣的重復(fù)序列也能引起RNA聚合酶的滑脫。在具有高G+C含量偏倚性的生物體中，可以有更高程度的由G或C核苷酸重復(fù)構(gòu)成的重復(fù)序列。因此，降低引起RNA聚合酶滑脫的可能性的ー種方法包括改變G或C核苷酸的延伸重復(fù)序列。
干擾ニ級(jí)結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致異源蛋白表達(dá)的下降。ニ級(jí)結(jié)構(gòu)可以隔離RBS序列或起始密碼子，且與蛋白質(zhì)表達(dá)的下降相關(guān)。莖-環(huán)結(jié)構(gòu)也可以參與轉(zhuǎn)錄中止和減弱。優(yōu)化的多核苷酸序列在核苷酸序列的RBS和基因編碼區(qū)中可以含有最少的ニ級(jí)結(jié)構(gòu)以允許轉(zhuǎn)錄和翻譯的改善。
另ー種可能影響異源蛋白表達(dá)的特征是限制性位點(diǎn)的存在?？梢酝ㄟ^(guò)除去可能干擾隨后轉(zhuǎn)錄單位亞克隆到宿主表達(dá)載體中的限制性位點(diǎn)優(yōu)化多核苷酸序列。
例如，可以通過(guò)識(shí)別由宿主異源表達(dá)所需的氨基酸序列開(kāi)始優(yōu)化過(guò)程。可以從該氨基酸序列設(shè)計(jì)候選多核苷酸或DNA序列。在設(shè)計(jì)合成DNA序列時(shí)，密碼子選擇的頻率可以與宿主表達(dá)有機(jī)體的密碼子選擇進(jìn)行比較和稀有宿主密碼子可以從合成序列中除去。此夕卜，合成的候選DNA序列可以被修飾以除去不想要的限制性酶切位點(diǎn)，以及添加或移除任何所需的信號(hào)序列、接頭或非翻譯區(qū)?？梢苑治龊铣蒁NA序列中可能會(huì)干擾的翻譯過(guò)程的ニ級(jí)結(jié)構(gòu)的存在，如G/C重復(fù)序列和莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。在候選DNA序列合成之前，可以檢驗(yàn)優(yōu)化的序列設(shè)計(jì)以確認(rèn)該序列正確編碼所需的氨基酸序列。最后，可以使用DNA合成技術(shù)合成候選DNA序列，如本領(lǐng)域中已知的那些合成技術(shù)。
在本發(fā)明的另ー個(gè)實(shí)施方式中，可以使用宿主生物體如熒光假單胞菌中的通用密碼子選擇來(lái)優(yōu)化異源多核苷酸序列的表達(dá)?？梢栽u(píng)估在宿主表達(dá)系統(tǒng)中被視為對(duì)于特定氨基酸優(yōu)選的稀有密碼子的百分比和分布。5%和10%的選擇率值可作為確定稀有密碼子的臨界值。例如，表I中列出的密碼子在熒光假單胞菌MB214基因組中的計(jì)算出現(xiàn)率小于5%，因而通常避免用于在熒光假單胞菌宿主中表達(dá)的優(yōu)化基因中。
表.I熒光假單胞菌MB214中出現(xiàn)率低于5%的密碼子
SSS使用的密碼子%出現(xiàn)率^
—GGly ~GGA3.26
IIleATA3.05
LLeuCTA1.78
CTT4.57
TTA1.89
RArgAGA1.39
AGG 2.72CGA 4.99_S SerTCT _428_
本發(fā)明考慮使用任何CRM197編碼序列，包括已針對(duì)在所使用的假單胞菌宿主細(xì)胞中表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化的任何序列。預(yù)想使用的序列可以進(jìn)行任何程度的優(yōu)化，包括，但不限干，優(yōu)化以消除在假單胞菌宿主細(xì)胞中出現(xiàn)率小于5%的密碼子、在假單胞菌宿主細(xì)胞中出現(xiàn)率小于10%的密碼子、稀有密碼子引起的翻譯中止、推定的內(nèi)部RBS序列、G或C核苷酸的延伸重復(fù)序列、干擾性ニ級(jí)結(jié)構(gòu)、限制性位點(diǎn)或它們的組合。
此外，在本發(fā)明的實(shí)施中任何有用的分泌前導(dǎo)序列的氨基酸序列可以由任何合適的核酸序列編碼。
表達(dá)系統(tǒng)
用于在假單胞菌宿主細(xì)胞以及可用于本發(fā)明的方法中的宿主細(xì)胞中表達(dá)異源蛋白質(zhì)的方法(包括可用的調(diào)控序列(例如，啟動(dòng)子、分泌前導(dǎo)序列和核糖體結(jié)合位點(diǎn)))在下列文獻(xiàn)中有描述，例如，題目均為“Method for Rapidly Screening Microbial Hosts toIdentify Certain Strains with Improved Yield and/or Quality in the Expressionof Heterologous Proteins”的美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2008/0269070和美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)12/610，207、題目為“Expression of Mammalian Proteins in Pseudomonas Fluorescensパ的美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2006/0040352和題目為“Process for Improved ProteinExpression by Strain Engineering”的美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2006/0110747,通過(guò)引用將所有這些文獻(xiàn)全文引入。這些出版物中，還描述了可用于實(shí)施本發(fā)明方法的細(xì)菌宿主菌株，其已被工程化以過(guò)表達(dá)折疊調(diào)節(jié)因子或其中為了增加異源蛋白質(zhì)的表達(dá)，已引入蛋白酶突變(包括缺失)。
前導(dǎo)序列
前導(dǎo)序列在下列文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2008/0193974和2010/0048864,題目均為 “Bacterial Leader Sequences for Increased Expression，，及美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2006/0008877,題目為“Expression systems with Sec-secretion”，其全部通過(guò)引用引入本文，以及美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2008/0269070和美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào) 12/610，207。
表2.示例性分泌前導(dǎo)序列
權(quán)利要求
1.用于在假單胞菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生重組CRM197蛋白的方法，所述方法包括 將編碼與指導(dǎo)CRM19轉(zhuǎn)移到周質(zhì)的分泌信號(hào)融合的CRM197蛋白的核苷酸序列接合到表達(dá)載體中； 用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化所述假單胞菌宿主細(xì)胞； 在適合所述重組CRM197蛋白表達(dá)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的假單胞菌宿主細(xì)胞； 其中得到的可溶性CRM197的產(chǎn)率為約O. 5克每升至約12克每升。
2.權(quán)利要求
I所述的方法，其中所述假單胞菌宿主細(xì)胞具有至少ー種蛋白酶表達(dá)的缺陷，或其中所述假單胞菌宿主細(xì)胞過(guò)表達(dá)至少ー種折疊調(diào)節(jié)因子。
3.權(quán)利要求
2所述的方法，其中所述假單胞菌宿主細(xì)胞是hslUV-、prcl-、degPl-、degP2-和 aprA-o
4.權(quán)利要求
3所述的方法，其中所述分泌前導(dǎo)序列是Azu、IbpS31A、CupA2、PbpA20V或Pbp。
5.權(quán)利要求
2所述的方法，其中所述假單胞菌宿主細(xì)胞具有Serralysin、HslU,HslV,Prcl、DegPl、DegP2或AprA表達(dá)的缺陷，或其中所述假單胞菌宿主細(xì)胞過(guò)表達(dá)DsbA、DsbB、DsbC 和 DsbD。
6.權(quán)利要求
5所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞過(guò)表達(dá)DsbA、DsbB、DsbC和DsbD，且分泌前導(dǎo)序列是Azu。
7.權(quán)利要求
5所述的方法,其中所述宿主細(xì)胞是Serralysin表達(dá)缺陷的,且分泌前導(dǎo)序列是Pbp或Azu。
8.權(quán)利要求
5所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是HslU和HslV表達(dá)缺陷的，且分泌前導(dǎo)序列是Pbp或Azu。
9.權(quán)利要求
I所述的方法，其中所述假單胞菌宿主細(xì)胞是野生型的，且分泌前導(dǎo)序列是 Pbp 或 Azu。
10.權(quán)利要求
I所述的方法，其中所述分泌前導(dǎo)序列是Azu、Pbp>IbpS31A、CupA2或PbpA20Vo
11.權(quán)利要求
I所述的方法，其中所述CRM197核苷酸序列已對(duì)于在假單胞菌宿主細(xì)胞中表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化。
12.權(quán)利要求
I所述的方法，其中所獲得的可溶性CRM197的產(chǎn)率是約O.5g/L、約O. 6g/L、約 O. 7g/L、約 O. 8g/L、約 O. 9g/L、約 lg/L、約 I. 5g/L、約 2g/L、約 2. 5g/L、約 3g/L、約 3. 5g/L、約 4g/L、約 4. 5g/L、約 5g/L、約 5. 5g/L、約 6g/L、約 6. 5g/L、約 7g/L、約 7. 5g/L、約 8g/L、約 8. 5g/L、約 9g/L、約 9. 5g/L、約 10g/L、約 10. 5g/L、約 I lg/L、約 12g/L、約 O. 5g/L 至約 Ig/L、約 O. 5g/L 至約 2g/L、約 O. 5g/L 至約 3g/L、約 O. 5g/L 至約 4g/L、約 O. 5g/L 至約 5g/L、約O. 5g/L 至約 6g/L、約 O. 5g/L 至約 7g/L、約 O. 5g/L 至約 8g/L、約 O. 5g/L 至約 9g/L、約 O. 5g/L 至約 10g/L、約 O. 5g/L 至約 I lg/L、約 O. 5g/L 至約 12g/L、約 lg/L 至約 2g/L、約 lg/L 至約3g/L、約 lg/L 至約 4g/L、約 lg/L 至約 5g/L、約 lg/L 至約 6g/L、約 lg/L 至約 7g/L、約 lg/L至約 8g/L、約 lg/L 至約 9g/L、約 lg/L 至約 10g/L、約 lg/L 至約 I lg/L、約 lg/L 至約 12g/L、約2g/L至約3g/L、約2g/L至約4g/L、約2g/L至約5g/L、約2g/L至約6g/L、約2g/L至約7g/L、約 2g/L 至約 8g/L、約 2g/L 至約 9g/L、約 2g/L 至約 10g/L、約 2g/L 至約 llg/L、約 2g/L 至約 12g/L、約 3g/L 至約 4g/L、約 3g/L 至約 5g/L、約 3g/L 至約 6g/L、約 3g/L 至約 7g/L、約3g/L至約8g/L、約3g/L至約9g/L、約3g/L至約10g/L、約3g/L至約llg/L、約3g/L至約12g/L、約4g/L至約5g/L、約4g/L至約6g/L、約4g/L至約7g/L、約4g/L至約8g/L、約4g/L 至約 9g/L、約 4g/L 至約 10g/L、約 4g/L 至約 llg/L、約 4g/L 至約 12g/L、約 5g/L 至約6g/L、約 5g/L 至約 7g/L、約 5g/L 至約 8g/L、約 5g/L 至約 9g/L、約 5g/L 至約 10g/L、約 5g/L至約llg/L、約5g/L至約12g/L、約6g/L至約7g/L、約6g/L至約8g/L、約6g/L至約9g/L、約 6g/L 至約 10g/L、約 6g/L 至約 llg/L、約 6g/L 至約 12g/L、約 7g/L 至約 8g/L、約 7g/L至約9g/L、約7g/L至約10g/L、約7g/L至約llg/L、約7g/L至約12g/L、約8g/L至約9g/L、約 8g/L 至約 10g/L、約 8g/L 至約 llg/L、約 8g/L 至約 12g/L、約 9g/L 至約 10g/L、約 9g/L 至約 llg/L、約 9g/L 至約 12g/L、約 lOg/L 至約 llg/L、約 lOg/L 至約 12g/L 或約 llg/L 至約 12g/L。
13.權(quán)利要求
I所述的方法，還包括在活性分析中測(cè)定重組CRM197蛋白的活性，其中約40%至約100%所產(chǎn)生的可溶性CRM197確定為活性的。
14.權(quán)利要求
13所述的方法，其中所述活性分析是免疫學(xué)分析或受體結(jié)合分析。
15.權(quán)利要求
I所述的方法，其中所述表達(dá)載體包含可操作地連接到所述蛋白編碼序列的Iac衍生啟動(dòng)子，且其中所述培養(yǎng)包括使用濃度為約O. 02至約I. OmM的IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)子，誘導(dǎo)時(shí)的細(xì)胞密度是約40至約200個(gè)吸光度単位(AU)的光密度，培養(yǎng)物的pH是從約6至約7. 5，和生長(zhǎng)溫度為約20至約35°C。
16.權(quán)利要求
I所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞是熒光假單胞菌。
專利摘要
本發(fā)明涉及在細(xì)菌宿主中生產(chǎn)重組蛋白的領(lǐng)域。特別是，本發(fā)明涉及用于從細(xì)菌宿主獲得高水平的重組CRM197蛋白的制備方法。
文檔編號(hào)C12P21/02GKCN102858981SQ201080066026
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2010年4月9日
發(fā)明者D·M·雷塔拉克, L·周, H·金 申請(qǐng)人:菲尼克斯公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan