專利名稱:以木糖生產(chǎn)廢液制造丙酮、丁醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種利用利用木糖生產(chǎn)廢液為原料利用微生物發(fā)酵制備丙酮、丁醇的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
丙酮是優(yōu)良的有機溶劑和重要的化工原料，廣泛應用于化工、塑料、有機合成、 油漆等工業(yè)，目前，丙酮消費量最大的為溶劑，占其消費總量觀％，其次是甲基丙烯酸甲酯 MMA和雙酚A，分別占其消費總量的23%和21%，其他還用于生產(chǎn)丙酮氰醇和異丙醇等。丁 IKbutanol, butyl alcohol and 1-butanol)是四碳醇，分子式為 C4H9OH,其分子量為 74. 12Da。丁醇是無色液體，具有獨特的氣味，誤吸丁醇蒸氣容易導致黏液組織疼痛，高濃度的丁醇具有麻醉作用。丁醇與有機溶劑完全互溶，但與水溶液部分互溶。據(jù)估計每年丁醇產(chǎn)量可達100-120億鎊，以目前的價格計算在市場銷售額占70-84億美元。目前丁醇作為汽油的替代品或者添加型燃料的可再生能源功能逐漸被人們所認識。丁醇和乙醇均可作為替代性燃料，然而丁醇具有比乙醇更多的優(yōu)勢，因為丁醇具有較高的能量值，與汽油的混合比更高。
最近幾年，原有價格的增長和全球氣候變暖現(xiàn)象，導致人們開發(fā)生產(chǎn)新型可再生能源。中國也是少有的將丙酮-丁醇發(fā)酵法一直保存至今的國家。我國7(Γ80年代主要以玉米為原料輔以糖蜜發(fā)酵進行丙酮、丁醇生產(chǎn)，存在與人爭糧的現(xiàn)象，在世界糧食危機日益顯著的情況下，全世界掀起了開展利用可再生資源或者生產(chǎn)廢棄物進行生物燃料的生產(chǎn)。 2007年，河南天之冠可再生能源有限公司提出了采用小麥B淀粉替代玉米發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇的方法(專利公開號CN101161818A)，但其本質(zhì)還是采用糧食作原料。2008年該公司聯(lián)合上海工業(yè)生物技術(shù)研發(fā)中心申請了將玉米皮高壓蒸煮、酶解直接發(fā)酵生產(chǎn)丙酮、丁醇的方法(CN101363031)，首次采用低成本原料、可再生資源進行丙酮丁醇的生產(chǎn)方法，以玉米皮為原料，該方法需要經(jīng)過高壓蒸煮、酶解糖化等過程，需要能耗高，酶解效率直接影響了丙酮、丁醇的得率。同年，王建設(shè)提出了利用秸稈聯(lián)產(chǎn)木糖生產(chǎn)丙酮丁醇的方法，該方法主要利用木糖渣在纖維素酶作用下水解為葡萄糖，利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)丙酮、丁醇，同樣面臨木糖渣利用纖維素酶酶解的高成本步驟。以上兩種發(fā)明均是利用可再生資源玉米皮和木糖渣進行生產(chǎn)丙酮、丁醇，具有切實的可行性和發(fā)展意義，但鑒于纖維素類物質(zhì)酶解效率及酶解成本一向為制約木質(zhì)纖維素類能源發(fā)展的主要因素。
木糖生產(chǎn)廢液中通產(chǎn)含有木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等雜糖，一般總糖含量在60-75% (W/W)之間。木糖占總糖的50-70% (W/W)之間。木糖生產(chǎn)廢液雖然雜糖含量高，采用色譜分離的技術(shù)由于設(shè)備投資高、運行成本太高而無法廣泛推廣。所以目前木糖生產(chǎn)廢液基本上只能低價賣給醬色廠作為食品上色使用。部分發(fā)明者用木糖母液提取糠醛(專利CN 1763024Α)，但其對環(huán)境污染較為嚴重。

發(fā)明內(nèi)容
[0005]本發(fā)明旨在提供一種以木糖生產(chǎn)廢液制造丙酮、丁醇的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)工藝復雜，丙酮、丁醇收率低、質(zhì)量不穩(wěn)定、生產(chǎn)成本高等問題。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是利用木糖生產(chǎn)廢液——木糖生產(chǎn)過程中木糖結(jié)晶分離后的顏色較深的粘稠液體作為原料，利用微生物發(fā)酵技術(shù)生物轉(zhuǎn)化糖源生產(chǎn)化工產(chǎn)品乙醇、丙酮、丁醇，屬于利用工業(yè)生產(chǎn)副產(chǎn)物或廢棄物生產(chǎn)高附加值的可再生能源的清潔生產(chǎn)技術(shù)。其具體工藝步驟如下
(1)將玉米秸、玉米芯、棉籽殼、甘蔗渣、稻草、小麥秸稈等植物原料進行加壓加熱預處理以及酸水解后，再對水解液進行木糖濃縮結(jié)晶，在結(jié)晶分離后得到的廢液一木糖母液; 木糖母液采用菲林法測定其還原糖含量為39Γ80%的生產(chǎn)廢棄糖液；通常采用高效液相色譜法(HPLC)測定其可溶性糖為木糖、葡萄糖、阿拉伯糖各種糖的濃度，該廢液的木糖含量為 25 70%，葡萄糖含量為5 25%，阿拉伯糖含量為5-25%。
(2)以木糖母液為發(fā)酵底物，復配氮源、磷源以及微量元素等配制成發(fā)酵培養(yǎng)基。 將木糖母液適當稀釋(一般按照49Γ12%的稀釋度進行稀釋)，使發(fā)酵培養(yǎng)基中可溶性糖含量為29TlO%，主要涉及以下二種工藝
工藝一以木糖母液按照49Γ12%的濃度稀釋，經(jīng)過陽離子、陰離子樹脂進行脫色、脫毒，以此作為發(fā)酵碳源，酵母粉0. 05% 5%，磷酸二氫鉀0. 0廣1%，磷酸氫二鉀0. 0Γ1%,乙酸銨 0. 05 0. 4%, ρΗ5· 0 7· 0，115°C 滅菌 20min。
工藝二 直接將木糖母液進行稀釋，稀釋濃度49Γ12%，添加0. 059Γ5%酵母粉或蛋白胨，或添加2% 4%的玉米漿，調(diào)節(jié)ρΗ至5. 0 7· 0，115°C滅菌20min。
(3)將活化菌株接種量按照2 10%體積比轉(zhuǎn)接入步驟(2)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵。以ATCC55025或者CICC8016可以發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇的任意一種或幾種作為發(fā)酵出發(fā)菌株，其菌株活化采用葡萄糖培養(yǎng)基或者玉米醪培養(yǎng)基。
(4)上述發(fā)酵條件為溫度為34、0°C，在厭氧管、厭氧瓶、厭氧罐等設(shè)備中靜置或輕微震蕩條件下進行發(fā)酵，發(fā)酵時間為48 120h，發(fā)酵完成后，采用氣相色譜法測定產(chǎn)物乙醇、 丙酮、丁醇含量。


圖1以木糖生產(chǎn)廢棄液為原料制造丙酮、丁醇的技術(shù)路線圖； 圖2葡萄糖和木糖生產(chǎn)廢液發(fā)酵結(jié)果圖；
采用本發(fā)明的積極效果是
1、工藝先進、經(jīng)濟效益顯著；本發(fā)明利用木糖母液為唯一碳源發(fā)酵生產(chǎn)丙酮、丁醇，實現(xiàn)了木糖生產(chǎn)副產(chǎn)物——木糖母液的開發(fā)利用，為丙酮、丁醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種新的原料和生產(chǎn)方法。本發(fā)明實施例中約5%的可溶性糖(木糖33g/L、葡萄糖8g/L、阿拉伯糖 8g/L)為碳源的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)丙酮、丁醇，其丁醇含量可達9. lg/L，丙酮含量可達 4. 2g/L，而單獨以5%的葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基發(fā)酵進行丙酮、丁醇生產(chǎn)，其丁醇含量為6. 4g/L，丙酮含量為3. Og/L。本發(fā)明的生產(chǎn)方法以木糖生產(chǎn)廢液作為碳源進行丙酮、 丁醇發(fā)酵，其生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化率明顯優(yōu)于以葡萄糖作為碳源進行丙酮、丁醇生產(chǎn)。該方法為化學品丙酮、丁醇生產(chǎn)提供了以一種新型、可再生的生物質(zhì)為原料，利用現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)為工業(yè)下腳料或廢棄物的高效利用提供了途徑和方法，提高了木糖生產(chǎn)廢液的綜合利用價值，將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益。
2、降低了設(shè)備投入技術(shù)生產(chǎn)成本；目前，木糖生產(chǎn)廢液主要作為小型食品加工廠對產(chǎn)品上醬色使用。還有一部分作為原料利用模擬移動床進行色譜分離提取阿拉伯糖等， 但是都面臨設(shè)備投資費用大，提取率低，提取成本高以及不能對原料進行全部利用等問題。 本發(fā)明較同比例葡萄糖為原料的轉(zhuǎn)化率更高，大大降低了設(shè)備投入技術(shù)生產(chǎn)成本。
3、社會效益顯著；本發(fā)明獨辟蹊徑，解決了木糖生產(chǎn)廢液利用難題，生產(chǎn)高附加值的化工產(chǎn)品；相比化工合成又節(jié)約了化石資源；同時，相比以玉米等糧食作物為發(fā)酵原料的生產(chǎn)方法，相對來說原料又價格低廉，且不與人爭糧，不與糧林爭地；另外，實現(xiàn)了木糖生產(chǎn)廢液的綜合利用以及降低了木糖生產(chǎn)的綜合成本費用。
本發(fā)明所述原料通常用于生產(chǎn)色素等低附加值的產(chǎn)品，而本發(fā)明卻利用其發(fā)酵生產(chǎn)丙酮、丁醇，不僅提高了該副產(chǎn)品的附加值，而且成為開發(fā)可再生能源，實現(xiàn)生物燃料發(fā)展的有效方法之一；同時解決了傳統(tǒng)丙酮、丁醇發(fā)酵所面臨的“與人爭糧”的狀況，是利用現(xiàn)有農(nóng)副產(chǎn)品——玉米芯、秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物進行木糖、木糖醇產(chǎn)品生產(chǎn)的廢棄產(chǎn)物聯(lián)產(chǎn)丙酮、丁醇，一方面提高了農(nóng)業(yè)廢棄物的產(chǎn)能附加值，另一方面為緩解國際大形勢下的“能源危機”和“糧食危機”之間的矛盾提供了一條切實可行的途徑。本發(fā)明利用生產(chǎn)木糖后的副產(chǎn)物木糖母液進行簡單的加工生產(chǎn)高附加值的能源產(chǎn)品——丙酮、丁醇，減少了木糖母液以低價賣出的運輸費用，生產(chǎn)過程屬于厭氧發(fā)酵成本設(shè)備投資少，可控性大，能耗低，與木糖或木糖醇等公開生產(chǎn)方法一起進行捆綁生產(chǎn)，可行性高，從現(xiàn)實意義上可以提高生物質(zhì)資源的利用效率，實現(xiàn)工業(yè)副產(chǎn)物的再利用。
實施例1
ATCC55025菌株和CICC8016利用木糖母液培養(yǎng)基生產(chǎn)丙酮丁醇 制備拜氏梭菌^Zo1Sirii/i beijerinckii ATCC55025。將上述菌株接種轉(zhuǎn)接至葡萄糖種子培養(yǎng)基的厭氧管中，轉(zhuǎn)接后，將厭氧管放入100°C水浴鍋中煮沸，立即冷卻至室溫，充氮氣，37°C靜置厭氧培養(yǎng)16 1 即為發(fā)酵種子液。
上述葡萄糖種子培養(yǎng)基是指IL中含有酵母浸膏3 g，牛肉浸膏10 g，胰蛋白胨 10 g，葡萄糖5 g，可溶性淀粉1 g，氯化鈉5 g、三水乙酸鈉3 g, L-半胱氨酸0.5 g， 115°C 滅菌 15min。
制備丙酮丁醇梭菌CZo1SiriiZi腫acetobutylicum CICC8016。將上述菌株接種轉(zhuǎn)接至5%的玉米醪種子培養(yǎng)基的厭氧管中，轉(zhuǎn)接后，將厭氧管放入100°C水浴鍋中煮沸，立即冷卻至室溫，充氮氣，37°C靜置厭氧培養(yǎng)16 1他即為發(fā)酵種子液。
上述5%玉米醪培養(yǎng)基是指50g玉米面加入900mL水中煮沸30min，然后冷卻至室溫定容至1L，121°C滅菌20min。
采用菲林試劑法測定木糖母液中還原糖含量為60. 7%，將IOmL木糖母液稀釋至 IOOmL,依次通過陽離子交換樹脂001 X 7，陰離子交換樹脂D301進行脫鹽、脫色預處理。
按照1:10比例稀釋的脫毒后木糖母液80mL，加入酵母粉0. lg, KH2PO4 0. 05g, K2HPO4 0. 05g,乙酸銨 0. 22g, MgSO4·7Η20 0. 02g, MnSO4·7Η20 0. OOlg, NaCl 0. OOlg, FeSO4'7H20 0. OOlg，加水定容至lOOmL，115°C滅菌15min，制備成木糖母液培養(yǎng)基。
按照5%的接種量接入ATCC55025活化種子于木糖母液培養(yǎng)基中；轉(zhuǎn)接后，充氮氣， 37°C靜置厭氧培養(yǎng)72h以上，即為乙醇、丙酮、丁醇發(fā)酵產(chǎn)物，乙醇含量為0. 7g/L，丙酮含量為 3. 5g/L，丁醇含量 8. 7g/L。
木糖母液培養(yǎng)基，按照5%的接種量接入CICC8016活化種子于木糖母液培養(yǎng)基中， 轉(zhuǎn)接后，充氮氣，37°C靜置厭氧培養(yǎng)72h以上，即為丙酮、丁醇發(fā)酵產(chǎn)物，乙醇含量為0. 9g/ L,丙酮含量為2. 5g/L，丁醇含量6. 3g/L。
實施例2
ATCC55025菌株利用木糖母液與葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)丙酮、丁醇
利用拜氏梭菌Closiridium beijerinckii ATCC55025在厭氧瓶中，木糖母液發(fā)酵培養(yǎng)基與以葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基進行丙酮丁醇發(fā)酵比較。
采用實施例1中制備的種子液，按照5%的接種量，轉(zhuǎn)接入含有50g/L葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接后，充氮氣，37°C靜置厭氧培養(yǎng)72h以上，即為丙酮、丁醇發(fā)酵產(chǎn)物。
上述所述葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，其成分為葡萄糖5g (滅菌后培養(yǎng)基HPLC測定其中含葡萄糖 48. 3g/L)，酵母粉 0. lg, KH2PO4 0. 05g, K2HPO4 0. 05g,乙酸銨 0. 22g，MgSO4·7Η20 0. 02g, MnS04*7H20 0. OOlg, NaCl 0. OOlg, FeS04*7H20 0. OOlg，定容至 lOOmL，115 °C 滅菌 15min。
以上所述木糖生產(chǎn)廢液發(fā)酵培養(yǎng)基，其成分為1:10稀釋后的脫毒木糖母液 90mL，酵母粉 0. lg, KH2PO4 0. 05g，K2HPO4 0. 05g，乙酸銨 0. 22g，MgSO4'7H20 0. 02g， MnS0,7H20 0. OOlg, NaCl 0. OOlg, FeS0,7H20 0. OOlg,加水定容至 IOOmL, 115 °C 滅菌 15min,滅菌結(jié)束后冷卻至室溫測定HPLC測定其中含木糖33. lg/L，葡萄糖8. 3g/L，阿拉伯糖 7. lg/L ；
采用木糖生產(chǎn)廢液發(fā)酵培養(yǎng)基所述方法測定整個發(fā)酵過程中可溶性糖利用率，為 33. 7g/L (其中木糖20. 7g/L，葡萄糖8. 3g/L，阿拉伯糖4. 7g/L)；測定產(chǎn)物含量丁醇含量為 9. 2g/L，丙酮含量為4. lg/L ；其中丙酮、丁醇得率為0. 39，轉(zhuǎn)化率為0. 18g/L · h。
采用葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基所述方法整個發(fā)酵過程中葡萄糖利用率為29. 4g/L ；測定產(chǎn)物含量丁醇含量為6. 4g/L，丙酮含量為3. 0g/L ；其中丙酮、丁醇得率為0. 31，轉(zhuǎn)化率為 0.13g/L · h。
木糖生產(chǎn)廢液發(fā)酵培養(yǎng)基和葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵結(jié)果優(yōu)略比較如圖2所示。
實施例3
不同濃度木糖母液直接添加0. 2%的酵母粉發(fā)酵生產(chǎn)丙酮、丁醇 按照實施例1所述制備拜氏梭菌C/osirii/i腫beijerinckii ATCC55025種子液。艮口， 將上述菌株接種轉(zhuǎn)接至葡萄糖種子培養(yǎng)基的厭氧管中，轉(zhuǎn)接后，將厭氧管放入100°C水浴鍋中煮沸，立即冷卻至室溫，充氮氣，37°C靜置厭氧培養(yǎng)16h即為發(fā)酵種子液。
木糖母液優(yōu)化優(yōu)化培養(yǎng)基配置IOOmL培養(yǎng)基5瓶，其中將木糖母液直接按照6% (v/v)的濃度梯度進行稀釋，分別加入酵母粉0. 2g酵母粉，pH自然，接入ATCC55025發(fā)酵種子液發(fā)酵72h，測定丙酮、丁醇含量，見表一
表一不同濃度木糖母液發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇的能力
權(quán)利要求
1. 一種以木糖生產(chǎn)廢液制造丙酮、丁醇的方法，其特征是是利用木糖生產(chǎn)廢液——木糖生產(chǎn)過程中木糖結(jié)晶分離后的顏色較深的粘稠液體作為原料，利用微生物發(fā)酵技術(shù)生物轉(zhuǎn)化糖源生產(chǎn)化工產(chǎn)品乙醇、丙酮、丁醇，屬于利用工業(yè)生產(chǎn)副產(chǎn)物或廢棄物生產(chǎn)高附加值的可再生能源的清潔生產(chǎn)技術(shù)，其具體工藝步驟如下(1)將玉米秸、玉米芯、棉籽殼、甘蔗渣、稻草、小麥秸稈等植物原料進行加壓加熱預處理以及酸水解后，再對水解液進行木糖濃縮結(jié)晶，在結(jié)晶分離后得到的廢液一木糖母液； 木糖母液采用菲林法測定其還原糖含量為39Γ80%的生產(chǎn)廢棄糖液；通常采用高效液相色譜法(HPLC)測定其可溶性糖為木糖、葡萄糖、阿拉伯糖各種糖的濃度，該廢液的木糖含量為 25 70%，葡萄糖含量為5 25%，阿拉伯糖含量為5-25% ；(2)以木糖母液為發(fā)酵底物，復配氮源、磷源以及微量元素等配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，將木糖母液適當稀釋(一般按照4% 12%的稀釋度進行稀釋)，使發(fā)酵培養(yǎng)基中可溶性糖含量為 29TlO%，主要涉及以下二種工藝工藝一以木糖母液按照49Γ12%的濃度稀釋，經(jīng)過陽離子、陰離子樹脂進行脫色、脫毒，以此作為發(fā)酵碳源，酵母粉0. 05% 5%，磷酸二氫鉀0. 0廣1%，磷酸氫二鉀0. 0Γ1%,乙酸銨 0. 05 0. 4%, ρΗ5· 0 7· 0，115°C 滅菌 20min ；工藝二 直接將木糖母液進行稀釋，稀釋濃度49Γ12%，添加0. 059Γ5%酵母粉或蛋白胨， 或添加2% 4%的玉米漿，調(diào)節(jié)ρΗ至5. 0 7· 0，115°C滅菌20min ；(3)將活化菌株接種量按照2 10%體積比轉(zhuǎn)接入步驟(2)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，以ATCC55025或者CICC8016可以發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇的任意一種或幾種作為發(fā)酵出發(fā)菌株，其菌株活化采用葡萄糖培養(yǎng)基或者玉米醪培養(yǎng)基；(4)上述發(fā)酵條件為溫度為34、0°C，在厭氧管、厭氧瓶、厭氧罐等設(shè)備中靜置或輕微震蕩條件下進行發(fā)酵，發(fā)酵時間為48 120h，發(fā)酵完成后，采用氣相色譜法測定產(chǎn)物乙醇、丙酮、丁醇含量。
專利摘要
一種以木糖生產(chǎn)廢液制造丙酮、丁醇的方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域：
，該方法利用木糖生產(chǎn)廢液為原料，利用微生物發(fā)酵技術(shù)生物轉(zhuǎn)化糖源生產(chǎn)化工產(chǎn)品丙酮、丁醇；其具體工藝步驟包括培養(yǎng)基制備、菌株活化、接種、發(fā)酵工藝步驟，獲得產(chǎn)物乙醇、丙酮、丁醇。本發(fā)明工藝先進、設(shè)備投入成本低；解決了木糖生產(chǎn)廢液利用難題，產(chǎn)品附加值高；相比化工合成又節(jié)約了化石資源；同時，相比糧食作物為發(fā)酵原料的生產(chǎn)方法原料價格低廉，且不與人爭糧，不與糧林爭地；實現(xiàn)了木糖生產(chǎn)廢液的綜合利用，降低了木糖生產(chǎn)的綜合成本費用，提高了生物質(zhì)資源的利用效率，實現(xiàn)了工業(yè)副產(chǎn)物的再利用，環(huán)境污染少，能耗低，社會效益顯著。
文檔編號C12P7/28GKCN102352381SQ201110298186
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月8日
發(fā)明者萬冬梅, 夏蕊蕊, 方詡, 程少博, 肖林, 覃樹林 申請人:山東龍力生物科技股份有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan